Técnicas de biologia molecular

Desde o final dos anos 1950 e início dos anos 1960, biólogos moleculares aprenderam a caracterizar, isolar e manipular os componentes moleculares das células e organismos. Estes componentes incluem DNA, o repositório de informação genética; RNA, um parente próximo do DNA, cujas funções variam de servir como uma cópia temporária de trabalho de DNA para reais funções estruturais e enzimáticas, bem como uma parte funcional e estrutural do aparelho de translação e proteínas, o principal tipo estrutural e enzimática da molécula nas células.

Clonagem expressão

Uma das técnicas mais básicas da biologia molecular para estudar a função da proteína é a clonagem de expressão. Nesta técnica, o DNA que codifica para uma proteína de interesse é clonado (usando PCR e / ou enzimas de restrição) em um plasmídeo (conhecido como um vetor de expressão). Este plasmídeo pode ter elementos promotor especial para conduzir a produção da proteína de interesse, e também pode ter marcadores de resistência a antibióticos para ajudar a seguir o plasmídeo.

Este plasmídeo pode ser inserido em qualquer células bacterianas ou animal. DNA introduzindo células bacterianas pode ser feito por transformação (via captação de DNA nu), conjugação (via contato célula-célula) ou por transdução (via vetor viral). Introdução de DNA em células eucarióticas, como as células animais, por meios físicos ou químicos é chamado de transfecção. Várias técnicas de transfecção diferentes estão disponíveis, tais como a transfecção de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção e transfecção lipossomas. DNA pode também ser introduzidas células eucarióticas utilizando vírus ou bactérias como transportadores, o último é às vezes chamado bactofection e em particular usa Agrobacterium tumefaciens. O plasmídeo pode ser integrado no genoma, resultando em uma transfecção estável, ou pode permanecer independente do genoma, chamado de transfecção transiente.

Em ambos os casos, o DNA que codifica para uma proteína de interesse é agora dentro de uma célula, a proteína e pode agora ser expressa. Uma variedade de sistemas, tais como promotores induzíveis e específicos de sinalização celular-fatores, estão disponíveis para ajudar a expressar a proteína de interesse em níveis elevados. Grandes quantidades de uma proteína pode ser extraída a partir da célula bacteriana ou eucarióticas. A proteína pode ser testado para atividade enzimática sob uma variedade de situações, a proteína pode ser cristalizado pelo que a sua estrutura terciária pode ser estudado, ou, na indústria farmacêutica, a atividade de novas drogas contra a proteína pode ser estudada.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A reação em cadeia da polimerase é uma técnica extremamente versátil para copiar DNA. Em breve, a PCR permite que uma única seqüência de DNA a ser copiado (milhões de vezes), ou alterado de forma predeterminada. Por exemplo, a PCR pode ser usado para introduzir os sites enzima de restrição, ou de sofrer mutações (alterações) bases de DNA em particular, este último é um método conhecido como "mudança rápida". PCR também pode ser usado para determinar se um fragmento de DNA é encontrado em uma biblioteca de cDNA. PCR tem muitas variações, como a transcrição reversa PCR (RT-PCR) para amplificação de RNA, e, mais recentemente, PCR em tempo real (qPCR) que permitem a medição quantitativa de moléculas de DNA ou RNA.

Eletroforese em gel

Eletroforese em gel é uma das principais ferramentas da biologia molecular. O princípio básico é que o DNA, RNA e proteínas podem ser separados por meio de um campo elétrico. Em eletroforese em gel de agarose, o DNA e RNA podem ser separados com base em tamanho, executando o DNA através de um gel de agarose. Proteínas podem ser separados com base em tamanho usando um gel SDS-PAGE, ou com base em tamanho e sua carga elétrica usando o que é conhecido como eletroforese em gel 2D.

Macromolécula blotting e sondagem

Os termos''norte'',''western''e''''leste blotting são derivados a partir do que inicialmente era uma piada de biologia molecular que jogou com o termo''Sul''mata-borrão, depois a técnica descrita por Edwin Southern para a hibridação de DNA apagado. Patricia Thomas, criador do blot de RNA que então ficou conhecido como o''norte''blot realmente não usar o termo. Combinações mais destas técnicas produzidas termos como''''southwesterns (DNA-proteína hibridações),''''northwesterns (para detectar a proteína-RNA interações) e''''farwesterns (interações proteína-proteína), que atualmente são encontradas na literatura.

Last Updated: Feb 1, 2011

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