De Lezers van de top-ranked wetenschappelijke dagboekenWetenschap en de Aard een recente golf van artikelen, onlangs in 13 Juli, de kwestie van 2012 kunnen zouden opgemerkt hebben van Wetenschap, met diep belang voor biologie en geneeskunde. Deze documenten, allen gepubliceerd dit jaar door samenwerking die door het laboratorium van het Onderzoekinstituut van Scripps van Professor Raymond Stevens worden geleid, verlichten een grote en medisch belangrijke familie van proteïnen genoemd G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs).
GPCRs zit in de van de celmembraan en betekenis diverse molecules buiten de cel, met inbegrip van geuren, hormonen, neurotransmitters, en licht. Na het binden van deze molecules, brengt GPCRs een specifieke reactie binnen de cel teweeg. Vele drugs, met inbegrip van allergie en hartmedicijn en drugs voor de ziekte van Parkinson en van Huntington, richten deze proteïnen.
Dit jaar, werd een gepubliceerd document 19 Januari (Liu et al., Wetenschap, 335, 1106) snel gevolgd door verwante publicaties op de kristalstructuren van een lipide GPCR (Hanson et al., Wetenschap, 335, 851, 17 Februari), de kappa opioid receptor (Wu et al., Aard, 485, 327, 21 Maart), en de nociceptinopioid receptor (Thompson et al., Aard, 485, 395, 17 Mei). De meest recente publicatie is op de 1.8 ångström high-resolution structuur van de A2A adenosine receptor (Liu et al., Wetenschap, 336, 232, 13 Juli) en is één van de hoogste resolutiestructuren tot op heden van een menselijke membraanproteïne. De structuur benadrukt de receptor en ligand als allosteric machine die door natrium, water, cholesterol, en lipiden wordt gecontroleerd.
Deze bevindingen werden mogelijk door technologieën gemaakt die door het Gemeenschappelijke Gezamenlijke Centrum van het Fonds NIH voor de Innovatieve Technologieën van het Membraan (JCIMPT) worden ontwikkeld en de biologische vragen die door het GPCR Netwerk, een deel worden nagestreefd van het EiwitInitiatief van de Structuur: Biologie bij het Nationale Instituut voor Algemene Medische Wetenschappen (NIGMS) in Bethesda, Maryland (NIGMS PSI: Biologie).
Ontwijkende GPCRs
De nauwkeurige, driedimensionele regeling van zijn constituerende atomen is op één of andere manier het uiteindelijke geheim van een proteïne. Ver meer dan zijn aminozuuropeenvolging, houdt de 3D structuur de sleutel aan het begrip van hoe een proteïne met zijn natuurlijke partnermolecules in het lichaam of met drugmolecules in wisselwerking staat.
Maar zijn de membraan eiwitstructuren zo moeilijk te bepalen aangezien zij waardevol zijn, en de belangrijkste structuren, veel van hen GPCRs, zijn vaak het ontwijkendst geweest. GPCRs is bijzonder brooze, breekbare proteïnen wanneer verankerd niet binnen hun inheemse celmembranen. Het Overhalen van hen opstellen om kristallen te vormen, zodat hun structuren door de kristallografie van de Röntgenstraal kunnen worden bepaald, is een formidabele uitdaging voor decennia geweest. Om deze reden, benadrukte het Gemeenschappelijke Fonds NIH van de membraan eiwituitdrukking en stabilisatie technologieën als prioriteitskwestie van innovatie en investering in 2004.
De eerste high-resolution menselijke bepaalde structuur GPCR was de β2 adrenergic receptor, die door het laboratorium van Stevens en het laboratorium van Brian Kobilka van Stanford in 2007 wordt gepubliceerd. In de volgende drie jaar, structureren slechts vier meer GPCR gemaakt het in literatuur-en vindend de structuren van honderden scheen andere medisch relevante GPCRs in menselijke proteome een taak voor toekomstige generaties.
Nu is er veel meer optimisme. Het „netwerk van Ray richt GPCRs zodat om representatieve structuren van de diverse GPCR structuurgroeperingen te krijgen, en voor deze gaan wij waarschijnlijk slechts ongeveer 100 structuren nodig hebben,“ bovengenoemde Bryan Roth, een farmacoloog bij de Universiteit van Noord-Carolina het waarvan laboratorium met het Netwerk GPCR samenwerkte om de kappa opioid en structuren van de nociceptinreceptor te vinden. De „gemeenschap kan slechts een paar meer te doen jaar nodig hebben dat, en natuurlijk, reeds wij structuren voor belangrijke GPCR drugdoelstellingen, zoals opioid receptoren vinden, die grote invloeden bij de toekomstige drugontwikkeling gaan hebben.“
De Technische Doorbraken
Wat was de spel-veranderende technische doorbraak?
„Ik word altijd gevraagd dat de vraag,“ bovengenoemde Stevens, „en het antwoord dat er niet alleen één doorbraak was, daar was ongeveer 15 afzonderlijke ontwikkelingen is, elke één elkaar kritisch nodig in combinatie met, en zij samen na oud kwamen. Dit zijn de resultaten van 20 jaar van verplichting door verscheidene internationale groepen die het gebied voorwaarts en het kritieke besluit bewegen door het Gemeenschappelijke Fonds NIH om zich bij ontwikkeling van de membraan de eiwittechnologie als prioriteitskwestie van belang en investering voor alle instituten te concentreren NIH.“
Sommige van deze doorbraken hebben de capaciteit van onderzoekers verbeterd om GPCRs in hoeveelheden te produceren en te zuiveren voldoende voor een kristallisatie-proces verwant aan uraniumverrijking. Andere doorbraken zijn gericht op het stabiliseren GPCRs, de waarvan kernstructuur uit zeven verbindende spiraalvormige elementen wordt samengesteld. „Wanneer u het membraan weghaalt, hebben deze schroeven het potentieel uiteen te vallen,“ bovengenoemde Stevens. „Het is mogelijk dat menselijke GPCRs om als deel van hun natuurlijke functie onstabiel evolueerde te zijn over stimulatie of het signaleren te vermijden.“
In De Loop Van de afgelopen acht jaar, hebben de onderzoekers met financiering van het Gemeenschappelijke Fonds NIH drie zeer belangrijke stabilisatie GPCR en kristallisatietechnieken ontwikkeld en ontwikkeld: het gebruik van fusieproteïnen die de basisstructuur GPCR stabiliseren en het meer kristalliseerbaar maken zonder zijn functie (Chun et al., Structuur, 20, 967, 2012) te beïnvloeden; het gebruik van drugsamenstellingen die aan een GPCR binden en het in een specifieke functionele bouw houden (Xu et al., Wetenschap, 332, 322, 2011); en het gebruik van een membraan-nabootsende matrijs van vet en watermolecules, riep de lipidic kubieke fase (LCP), waarin GPCRs, cholesterol, en ligands kristallen kan gemakkelijker vormen dan zij in traditionele detergent oplossingen doen.
De Verbeteringen van deze technieken zijn door gekomen de LCP hulpmiddelreeks te automatiseren en uit te breiden. Stevens en HulpProfessor Vadim Cherezov bouwden op het werk LCP van structurele bioloog Martin D. Caffrey voort in de Landauer Dublin, Ehud van de Universiteit van de Drievuldigheid bij de Universiteit van Zürich, en Jurg Rosenbusch in Biozentrum in Bazel, Zwitserland. „Stevens en Cherezov gingen werkelijk de toegang en het meer algemene gebruik van LCP voor het kristalliseren van membraanproteïnen vooruit,“ de bovengenoemde Kin van Jean, de Nih- programmadirecteur voor zowel het Gemeenschappelijke Fonds JCIMPT als het Netwerk GPCR.
De „groep ontwikkelde de hulpmiddelen van het prekristallisatieonderzoek, de robotica van de volgende-generatiekristallisatie, ook weergavetechnologieën, en het werken met personeel bij beamlines GM/CA bij de Geavanceerde Bron van het Foton (APS) om technologie te ontwikkelen om LCP af te tasten om van de diffractie de plaats te bepalen waar de kristallen,“ bovengenoemde Afdeling Smith, directeur van PSI zijn: Het programma van de Biologie dat samen met het Gemeenschappelijke Fonds NIH financiering voor het werk heeft verstrekt.
Wanneer de kristallen GPCR zijn gevormd en geïsoleerd, worden zij verzonden naar een speciale kristallografie van de Röntgenstraal faciliteit-vaak de Geavanceerde Bron van het Foton bij Nationaal Laboratorium Argonne in Argonne, Illinois. „In Argonne hebben zij de Röntgenstraal in de loop van de jaren kleiner en kleiner kunnen krijgen,“ bovengenoemde Stevens, „en het beamlineteam bij GMCA dat door Janet Smith, Robert Fischetti, en Nukri Sanishvili have creatief ongelooflijk en ontvankelijk tot de behoeften van ons onderzoek door dergelijke nieuwe technologieën wordt geleid te ontwikkelen zoals de rastering benadering om micro-kristallen in de kleine röntgenstraal met onze steekproeven als enkel één voorbeeld te vinden.“
Het Steek Houden van Van de Gegevens
Zelfs wanneer de kristalstructuur van een GPCR is opgelost, moeten de wetenschappers verdere analyses maken om volledig gebruik van de structurele gegevens te maken en de receptordynamica is van centraal belang aan hun functie. GPCRs functioneert typisch voor een deel door aan partner „ligand“ molecules te binden die buiten de cel aanwezig is; die bindende gebeurtenis kan of kan een biochemisch signaal binnen de cel niet in werking stellen.
Bij Onderzoek Scripps, past het laboratorium van Kurt W-thrich, de Laureaat van Nobel en Cecil H. en Ida M. Green Professor van Structurele Biologie, nuclear magnetic resonance (NMR)technieken toe om te bepalen hoe conformational evenwicht en de intramoleculaire tariefprocessen in GPCRs tot hun bindende en signalerende functies bijdragen. „Mijn laboratorium heeft jarenlang met Ray gewerkt, combinerend onze NMR deskundigheid met hun kristallografiedeskundigheid,“ bovengenoemd W -w-thrich.