TSRI ontwikkelt nauwkeurige structurele kaart van complexe moleculaire machines in cellen

Published on June 6, 2014 at 9:29 AM · No Comments

Een team dat door onderzoekers bij The Scripps Research Institute wordt geleid heeft (TSRI) geavanceerde elektronenmicroscopietechnieken gebruikt om de eerste nauwkeurige structurele kaart van Bemiddelaar, één van de grootste en meest complexe „moleculaire machines“ in cellen te bepalen.

De Bemiddelaar is essentieel voor de verordening van de activiteit van de meeste genen en werkt in de cellen van alle planten en dieren. De afbeelding van zijn structuur-die meer dan twee dozijn unieke proteïne omvat moeten subeenheid-vertegenwoordigt een significante vooruitgang in basiscelbiologie en zou licht op medische voorwaarden afwerpen die de dysfunctie van de Bemiddelaar, van kanker impliceren aan geërfte ontwikkelingswanorde.

Het vinden toont aan hoe de onlangs ontwikkelde moleculaire weergavemethodes kunnen worden toegepast om grote en belangrijke eiwitcomplexen te kenmerken.

_„Kunnen te be*palen hoe deze groot moleculair machine kijken, hoe zij organiseren en hoe zij be*wegen, kritiek voor een beter be*grijpen van veel zeer belangrijk proces in cel,“ zeggen TSRI Verwant Professor Francisco J. Asturias, de hoger auteur van de studie, dat publiceren op Juni 5, 2014 door de dagboek Cel.

Een Complexe Machine

De gedetailleerde kaart van Bemiddelaar komt bijna 20 jaar nadat het complex eerst door de Universitaire bioloog Roger Kornberg van Stanford en collega's werd beschreven. Kornberg, de waarvan laboratoriumleden tegelijkertijd Asturias omvatten, won later een Nobelprijs voor zijn werk aangaande de machines van de gentranscriptie van cellen.

Deze machines van de gentranscriptie evolueerden om één van de meest fundamentele en routinefuncties in biologie uit te oefenen, namelijk het kopiëren van de informatie die in DNA van genen in draagbaar RNA „afschriften“ wordt gecodeerd - wat van die verblijf en het werk in de celkern, terwijl anderen weggaan de kern en in proteïnen vertaald.

Elke cel heeft zijn eigen patroon van de activiteit van de gentranscriptie, dat door een regelgevend systeem wordt bepaald waarin de Bemiddelaar een onontbeerlijke rol speelt. De reusachtige complexe Bemiddelaar laat transcriptiefactoren en andere regelgevende proteïnen toe om polymerase II te beïnvloeden van RNA die eigenlijk de transcriptie uitvoert.

Om precies te begrijpen hoe de Bemiddelaar zijn werk doet, hebben de wetenschappers een nauwkeurig 3-D model van zijn architectuur, met inbegrip van de plaatsen van al zijn subeenheidsproteïnen nodig gehad en een beschrijving van de verschillende conformationsBemiddelaar kan goedkeuren om interactie tussen andere componenten van de transcriptiemachines te beïnvloeden.

Nochtans, is de Bemiddelaar enorm door biologische normen: de versie die in gist wordt gevonden heeft 25 verschillende eiwitsubeenheden en de menselijke versie heeft 30. Het is ook hoogst flexibel. Die combinatie van grote grootte, hoge ingewikkeldheid en hoge flexibiliteit maakt tot het een slechte kandidaat voor de methodes van de hoge resolutieweergave zoals de kristallografie van de Röntgenstraal of de nuclear magnetic resonancespectroscopie.

Als post-doctorale onderzoeker in het laboratorium Kornberg in de jaren '90, hielp Asturias het gebruik van „enig deeltjes“ elektronenmicroscopie voor (EM) de weergave van grote transcriptiecomplexen zoals Bemiddelaar de weg bereiden. Het enig-Deeltje EM vereist zeer het nemen van duizenden afzonderlijke beelden EM van een deeltje rente-typisch „lawaaierige“ beelden, die een deeltje in verschillende richtlijnen en misschien ook in een aantal verschillende conformations afschilderen. Van Al deze gegevens moeten worden gefiltreerd en worden het gemiddelde genomen om het lawaai te verminderen en nuttige 3-D beelden op te brengen. In een studie van 1999 in Wetenschap, gebruikten Asturias en de collega's een vroege vorm van enig-deeltje EM om de eerste ruwe structuur van de volledige complexe Bemiddelaar te bepalen.

In het decennium en de helft sedertdien is de Groep van Asturias technieken blijven gebruiken EM om Bemiddelaar te bestuderen. Anderen hebben high-resolution technieken gebruikt om de individuele subeenheden van de Bemiddelaar of gedeelten van het complex te bestuderen. Nochtans, een duidelijk en nauwkeurig beeld van hoe de gehele structuurpasvormen samen tot nu toe ontwijkend is geweest.

Het Draaien van een Model op zijn Hoofd

De volledige structuur te bepalen duidelijk, begonnen Asturias en zijn collega's door hoogst zuivere hoeveelheden van een standaardgistversie van het bemiddelaar-reinigingsproces te veroorzaken zelf die een belangrijke uitdaging zijn. Zij gebruikten toen deze inzameling van de deeltjes van de Bemiddelaar om ruwweg 85.000 beelden te registreren EM, die zij volgens bouw categoriseerden. Het Het Gemiddelde Nemen van van deze bracht nog het duidelijkste 3D model van de structuur van de Bemiddelaar, aan een resolutie van ongeveer 18 Ångström (1.8 miljardsten van een meter) op.

Gebruikend verschillende andere biochemische analyses, met inbegrip van de aftrekking van verschillende eiwitsubeenheden om te zien hoe de beelden EM veranderden, konden de wetenschappers de nauwkeurige plaatsen van 25 eiwitsubeenheden van de gistBemiddelaar identificeren.

Deze afbeelding resulteerde in een uitvoerige revisie van het oude ruwe model van de hoofd-midden-staartstructuur van de Bemiddelaar. „Nadat wij van alle eiwitsubeenheden de plaats bepaalden, realiseerden wij dat de hoofdmodule bij de bovenkant van Bemiddelaar is, niet de bodem zoals was gedacht,“ bovengenoemde kuang-Lei Tsai, een post-doctorale kameraad in het Laboratorium van Asturias, dat eerste auteur van de studie was. „Deze nieuwe gegevens hebben ons helpen van vele vorige biochemische observaties steek houden.“

Asturias en Tsai werkten daarna met het laboratorium van Joan samen en Ron conaway-Joan is een andere Kornberg oudstudent-bij het Instituut Stowers voor Medisch Onderzoek naar Kansas City. Het team Conaway had gewerkt aan menselijke Bemiddelaar en nu zuivere steekproeven voor weergave EM, evenals biochemische analyses van de subeenheidsplaatsen verstrekt.

Dit werk openbaarde dat de menselijke Bemiddelaar de zelfde brede architectuur deelt impliceren, die dat deze structuur, grotendeels, door de miljard jaar van evolutie is behouden die gist en mensen scheidt. „Hebben de twee Bemiddelaars Fundamenteel gelijkaardige algemene structuur,“ bovengenoemde Tsai.

In het laatste deel van de studie, gebruikten Asturias en Tsai de nieuwe structurele gegevens om te tonen hoe Bemiddelaar waarschijnlijke veranderingen zijn bouw aangezien het met de polymerase van RNA enerzijds, en diverse transcriptieregelgevers anderzijds in wisselwerking staat.

„Deze studie heeft ons een vrij definitief beeld van de architectuur van de Bemiddelaar en hoe de verschillende subeenheden worden georganiseerd, zodat wij kan beginnen om voor een atoomresolutiemodel te ijveren gegeven,“ bovengenoemd Asturias. „Wij willen ook beter begrijpen hoe de Bemiddelaar met al die andere proteïnen in wisselwerking staat om transcriptie op een geregelde manier eigenlijk uit te voeren.“

Naast Asturias, waren Tsai en Joan en Ron Conaway, de medeauteurs van de studie, de „Architectuur van de Subeenheid en de Functionele Modulaire Herschikkingen van de Transcriptional Complexe Bemiddelaar,“ Chieri tomomori-Sato en Shigeo Sato, ook van het Instituut Stowers voor Medisch Onderzoek.

Het onderzoek werd gefinancierd voor een deel door de Nationale Instituten van Gezondheid (toelagen R01 GM67167, R01 GM41628) en het Fonds van het Medische Onderzoek van Helen Nelson bij de Grotere Communautaire Stichting van Kansas City.

Bron The Scripps Research Institute

Read in | English | Español | Français | Deutsch | Português | Italiano | 日本語 | 한국어 | 简体中文 | 繁體中文 | Nederlands | Русский | Svenska | Polski