TSRI développe le plan structurel précis des machines moléculaires complexes en cellules

Published on June 6, 2014 at 9:29 AM · No Comments

Une équipe aboutie par des chercheurs au The Scripps Research Institute (TSRI) a employé des techniques avancées de microscopie électronique pour déterminer le premier plan structurel précis du Médiateur, une des plus grandes et la plupart des complexes « machines moléculaires » en cellules.

Le Médiateur est essentiel pour le règlement de la plupart d'activité de gènes et travaille dans les cellules de tous les végétaux et animaux. Le mappage du son structure-qui comprend plus de deux douzaine seules protéines sous-unité-représentent une amélioration significatif en biologie cellulaire de base et devraient jeter la lumière sur des conditions médicales concernant le dysfonctionnement du Médiateur, du cancer aux troubles du développement hérités.

La conclusion explique comment des techniques d'imagerie moléculaires développées récemment peuvent être appliquées pour caractériser de grands et importants composés de protéine.

« Pouvoir déterminer à quoi ces grandes machines moléculaires ressemblent, comment elles sont dispensées et comment elles déménagent, sera critique pour une meilleure compréhension de beaucoup de procédés principaux en cellules, » a dit le Professeur Agrégé Francisco J. Asturies, l'auteur supérieur de TSRI de l'étude, qui a été publiée le 5 juin 2014 par la Cellule de tourillon.

Une Machine Complexe

Le plan détaillé du Médiateur vient presque 20 ans après le composé a été décrit la première fois par le biologiste Roger Kornberg d'Université de Stanford et les collègues. Kornberg, dont les membres de laboratoire ont alors inclus les Asturies, plus tard a gagné un Prix Nobel pour son travail sur les machines de transcription des gènes des cellules.

Ces machines de transcription des gènes ont évolué pour remplir un des fonctionnements les plus fondamentaux et les plus courants dans la biologie, à savoir la copie d'information encodée dans l'ADN des gènes dans l'ARN portatif « transcriptions » - certains dont séjour et travail au noyau de cellules, alors que d'autres quittent le noyau et sont traduites en protéines.

Chaque cellule fait déterminer sa propre configuration d'activité de transcription des gènes, par un pouvoir réglementaire en lequel le Médiateur joue un rôle indispensable. Le composé énorme de Médiateur permet à des facteurs de transcription et à d'autres protéines de réglementation d'influencer la Polymérase ARN II qui exécute réellement la transcription.

Pour comprendre avec précision comment le Médiateur réalise son travail, les scientifiques ont eu besoin d'un modèle à trois dimensions précis de son architecture, y compris les emplacements de toutes ses protéines de sous-unité et une description du Médiateur différent de conformations peut adopter pour influencer des interactions entre d'autres composants des machines de transcription.

Cependant, le Médiateur est énorme par des normes biologiques : la version trouvée en levure a 25 sous-unités distinctes de protéine et la version humaine a 30. Elle est également hautement flexible. Cette combinaison de complexité et de souplesse de grande taille et élevées de haut lui effectue un pauvre candidat pour des techniques d'imagerie de haute résolution telles que la cristallographie de Rayon X ou la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire.

En Tant Que chercheur post-doctoral dans le laboratoire de Kornberg pendant les années 1990, les Asturies ont aidé le pionnier l'utilisation de la microscopie électronique « de particules uniques » (EM) pour la représentation de grands composés de transcription tels que le Médiateur. la FIN DE SUPPORT d'Unique-Particule exige la prise des milliers d'images indépendantes de FIN DE SUPPORT d'une particule des images « bruyantes » d'intérêt-type très, qui dépeignent une particule dans différentes orientations et peut-être également dans un certain nombre de différentes conformations. Toutes ces données doivent être filtrées et ramenées à une moyenne pour réduire le bruit et pour fournir les illustrations à trois dimensions utiles. Dans une étude 1999 en la Science, les Asturies et les collègues ont employé une forme précoce de FIN DE SUPPORT d'unique-particule pour déterminer la première structure approximative du plein composé de Médiateur.

Pendant la décennie et une moitié depuis lors, le groupe des Asturies a prolongé pour employer des techniques de FIN DE SUPPORT pour étudier le Médiateur. D'autres ont employé des techniques à haute résolution pour étudier différentes sous-unités de Médiateur ou parties du composé. Cependant, une illustration dégagée et précise de la façon dont les ajustements entiers de structure ensemble a été évasif jusqu'ici.

Rotation d'un Modèle sur sa Tête

Pour déterminer la pleine structure de manière dégagée, les Asturies et ses collègues ont commencé en produisant les quantités hautement pures d'une version normale de levure du procédé de purification de Médiateur-le elle-même étant un défi majeur. Ils ont alors employé ce ramassage de particules de Médiateur pour enregistrer approximativement 85.000 images de FIN DE SUPPORT, qu'ils ont classées par catégorie selon la conformation. L'Établissement D'une Moyenne de ces derniers a fourni le modèle 3D le plus dégagé pourtant de la structure de Médiateur, à une définition d'environ 18 Angströms (1,8 milliardièmes d'un compteur).

Utilisant de diverses autres analyses biochimiques, y compris la soustraction de différentes sous-unités de protéine pour voir comment les images de FIN DE SUPPORT changées, les scientifiques pouvaient recenser les emplacements précis des sous-unités de la protéine du Médiateur 25 de levure.

Ce mappage a eu comme conséquence une révision complète du vieux modèle approximatif de la structure du tête-moyen-arrière du Médiateur. « Après Que nous avons localisé toutes les sous-unités de protéine, nous nous sommes rendus compte que le module principal est en haut de Médiateur, pas le bas en tant qu'eu été pensée, » a dit Kuang-Lei Tsai, un boursier post-doctoral dans le Laboratoire des Asturies, qui était le premier auteur de l'étude. « Ces données neuves nous ont aidés à sembler raisonnable de beaucoup d'observations biochimiques précédentes. »

Les Asturies et le Tsai ensuite ont collaboré avec le laboratoire de Joan et Ron Conaway-Joan est un autre Kornberg ancien-à l'Institut de Stowers pour la Recherche Médicale à Kansas City. L'équipe de Conaway avait travaillé sur le Médiateur humain et les échantillons purs maintenant fournis pour la représentation de FIN DE SUPPORT, ainsi que les analyses biochimiques des emplacements de sous-unité.

Ce travail a indiqué que le Médiateur humain partage la même architecture grande, impliquant que cette structure a été pour la plupart économisée tout au long de milliard d'années d'évolution qui séparent la levure et des êtres humains. « Fondamentalement les deux Médiateurs ont la structure générale assimilée, » a dit Tsai.

Dans la dernière partie de l'étude, les Asturies et le Tsai ont employé les données structurelles neuves pour afficher comment le Médiateur change vraisemblablement sa conformation pendant qu'elle agit l'un sur l'autre avec de la Polymérase ARN d'une part, et régulateurs variés de transcription de l'autre.

« Cette étude nous a donné une illustration assez définitive de l'architecture de Médiateur et comment les différentes sous-unités sont dispensées, ainsi nous peut commencer à travailler vers un modèle atomique de définition, » les Asturies ont indiqué. « Nous voulons également comprendre mieux comment le Médiateur agit l'un sur l'autre avec toutes ces autres protéines pour effectuer réellement la transcription d'une façon réglée. »

En plus des Asturies, Tsai et Joan et Ron Conaway, les co-auteurs de l'étude, la « Architecture de Sous-unité et les Réarrangements Modulaires Fonctionnels du Composé Transcriptionnel de Médiateur, » étaient Chieri Tomomori-Sato et Shigeo Sato, aussi de l'Institut de Stowers pour la Recherche Médicale.

La recherche a été financée en partie par les Instituts de la Santé Nationaux (concessions R01 GM67167, R01 GM41628) et les Fonds de Recherche Médicaux de Hélène Nelson à la Fondation Plus Grande de la Communauté de Kansas City.

The Scripps Research Institute de Source

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