TSRI entwickelt genaue strukturelle Karte von komplexen molekularen Maschinen in den Zellen

Published on June 6, 2014 at 9:29 AM · No Comments

Ein Team, das von den Forschern am The Scripps Research Institute geführt wird, (TSRI) hat hoch entwickelte Elektronenmikroskopietechniken verwendet, um die erste genaue strukturelle Karte von Vermittler, eine zu bestimmen der größten und meisten komplexen „molekularen Maschinen“ in den Zellen.

Vermittler ist für die Regelung der meisten Aktivität der Gene entscheidend und arbeitet in den Zellen aller Pflanzen und Tiere. Das Abbilden von seinem, Zelle-das mehr umfaßt, als zwei Dutzend eindeutiges Protein einen beträchtlichen Fortschritt in der grundlegenden Zellbiologie Untereinheit-darstellt und Leuchte auf den Beschwerden verschütten sollte, welche die Funktionsstörung des Vermittlers mit einbeziehen, von Krebs zu geerbten Entwicklungsstörungen.

Das Finden zeigt, wie neuentwickelte molekulare Darstellungsmethoden angewendet werden können, um die großen und wichtigen Proteinkomplexe zu kennzeichnen.

„Sein, zu bestimmen, wie diese großen molekularen Maschinen schauen, wie sie organisiert werden und wie sie umziehen, ist für ein besseres Verständnis vieler Schlüsselprozesse in den Zellen kritisch,“ sagte TSRI-Außerordentlichen Professor Francisco J. Asturien, der ältere Autor der Studie, die am 5. Juni 2014 durch die Zapfen Zelle veröffentlicht wurde.

Eine Komplexe Maschine

Die ausführliche Karte des Vermittlers kommt fast 20 Jahre nach dem Komplex wurde beschrieben zuerst vom Universität von Stanfords-Biologen Roger Kornberg und von den Kollegen. Kornberg, dessen Laborbauteile zu der Zeit Asturien umfaßten, gewann später einen Nobelpreis für seine Arbeit über die Genübertragungsmaschinerie von Zellen.

Diese Genübertragungsmaschinerie entwickelte, um eine der grundlegendsten und routinemäßigsten Aufgaben in der Biologie wahrzunehmen, nämlich kopieren von den Informationen, die in der DNS von Genen in tragbare RNS „Abschriften“ - einige kodiert wurden, von denen Stütze und Arbeit im Zellkern, während andere den Kern verlassen und in Proteine übertragen werden.

Jede Zelle hat sein eigenes Muster der Genübertragungsaktivität, bestimmt durch ein Aufsichts- und Kontrollsystem, in dem Vermittler eine unentbehrliche Rolle spielt. Der enorme Vermittlerkomplex aktiviert Übertragungsfaktoren und andere regelnde Proteine, die RNS-Polymerase II zu beeinflussen, die wirklich die Übertragung durchführt.

Um genau zu verstehen wie Vermittler seine Arbeit erledigt, haben Wissenschaftler ein genaues 3-D Baumuster seiner Architektur, einschließlich die Einbauorte aller seiner Untereinheitsproteine benötigt und eine Beschreibung des unterschiedlichen Anpassungen Vermittlers kann annehmen um Interaktionen zwischen anderen Bauteilen der Übertragungsmaschinerie zu beeinflussen.

Jedoch ist Vermittler durch biologische Normen enorm: die Version, die in der Hefe gefunden wird, hat 25 eindeutige Protein-Untereinheiten und die menschliche Version hat 30. Sie ist auch in hohem Grade flexibel. Diese Kombination der großen, hohen Komplexität und der hohen Flexibilität macht es einen armen Kandidaten für Darstellungsmethoden der hohen Auflösung wie Röntgenstrahlkristallographie oder magnetische Resonanz- Kernspektroskopie.

Als Habilitationsforscher im Kornberg-Labor in den neunziger Jahren, half Asturien Pionier der Gebrauch von Elektronenmikroskopie „des einzelnen Partikels“ (EM) für die Darstellung von großen Übertragungskomplexen wie Vermittler. Einzel-Partikel EM benötigt das Nehmen von Tausenden unterschiedlicher EM-Bilder eines Partikels von Zinsen-typisch sehr „lauten“ Bildern, die einen Partikel in den verschiedenen Orientierungen und möglicherweise auch in einigen verschiedenen Anpassungen darstellen. Aller dieser Daten müssen gefiltert werden und berechnet werden, um die Geräusche zu verringern und nützliche 3-D Abbildungen zu erbringen. In einer Studie 1999 in der Wissenschaft, verwendeten Asturien und Kollegen ein frühes Formular von Einzelpartikel EM, um die erste raue Zelle des vollen Vermittlerkomplexes zu bestimmen.

Zur Hälfte das Jahrzehnt und seit damals, Asturiens ist Gruppe fortgefahren, EM-Techniken zu verwenden, um Vermittler zu studieren. Andere haben hochauflösende Techniken verwendet, um einzelne Vermittleruntereinheiten oder Teile des Komplexes zu studieren. Jedoch eine klare und genaue Abbildung von, wie die ganzen Zellensitze zusammen bis jetzt ausweichend gewesen ist.

Drehen eines Baumusters auf seinem Kopf

Um die volle Zelle offenbar zu bestimmen, fingen Asturien und seine Kollegen an indem sie in hohem Grade reine Mengen einer Standardhefeversion des Vermittler-d Reinigungsprozesses produzierten selbst, der eine bedeutende Herausforderung ist. Sie verwendeten dann diese Sammlung Vermittlerpartikel, um ungefähr 85.000 EM-Bilder aufzuzeichnen, die sie entsprechend Anpassung kategorisierten. Die Mittelwertbildung diese erbrachte das klarste Baumuster 3D dennoch der Vermittlerzelle, zu einer Auflösung von ungefähr 18 Ångström (1,8 Billionste eines Meters).

Unter Verwendung der vielen anderen biochemischen Analysen einschließlich den Abzug von den verschiedenen Protein-Untereinheiten, zu sehen, wie die EM-Bilder, die, die Wissenschaftler geändert wurden, in der Lage waren, die genauen Einbauorte von den 25 Protein-Untereinheiten Hefe Vermittlers zu kennzeichnen.

Dieses Abbilden ergeben eine umfassende Änderung des alten rauen Baumusters von Zelle das Kopf-mittlerheck des Vermittlers. „Nachdem wir alle Protein-Untereinheiten lokalisierten, stellten wir, dass der Hauptblock an der Spitze des Vermittlers ist fest, nicht die Unterseite als gehabt gewesen Gedanke,“ sagte Kuang-Leu Tsai, ein promovierter wissenschaftlicher Mitarbeiter im Asturien-Labor, das erster Autor der Studie war. „Diese neuen Daten haben uns geholfen, sinnvoll von vielen vorhergehenden biochemischen Beobachtungen zu sein.“

Asturien und Tsai als Nächstes arbeiteten mit dem Labor von Joan zusammen und Ron Conaway-Joan ist ein anderes Kornberg Schüler-am Stowers-Institut für Medizinische Forschung in Kansas City. Das Conaway-Team hatte an menschlichem Vermittler und jetzt zur Verfügung gestellten reinen Proben für EM-Darstellung sowie biochemischen Analysen der Untereinheitseinbauorte gearbeitet.

Diese Arbeit deckte auf, dass menschlicher Vermittler die gleiche breite Architektur teilt und bedeutet, dass diese Zelle in den meisten Fällen während der Milliarde Jahre der Entwicklung konserviert worden ist, die Hefe und Menschen sich trennen. „Im Allgemeinen haben die zwei Vermittler ähnliche Gesamtzelle,“ sagte Tsai.

Im letzten Teil der Studie, verwendeten Asturien und Tsai die neuen Strukturdaten, um zu zeigen, wie Vermittler wahrscheinlich seine Anpassung, während sie auf RNS-Polymerase einerseits einwirkt, und verschiedene Übertragungsregler auf dem anderen ändert.

„Diese Studie hat uns eine ziemlich endgültige Abbildung der Vermittlerarchitektur und wie die verschiedenen Untereinheiten organisiert werden, also wir kann beginnen, auf ein Atomauflösungsbaumuster hinzuarbeiten gegeben,“ sagte Asturien. „Wir möchten auch besser verstehen, wie Vermittler auf alle jene anderen Proteine einwirkt, um Übertragung in einer geregelten Art wirklich durchzuführen.“

Zusätzlich zu Asturien waren Tsai und Joan und Ron Conaway, die Mitverfasser der Studie, „die Untereinheits-Architektur und die Modularen Funktionellneuordnungen des Transcriptional Vermittler-Komplexes,“ Chieri Tomomori-Sato und Shigeo Sato, auch des Stowers-Instituts für Medizinische Forschung.

Die Forschung wurde im Teil von den Nationalen Instituten der Gesundheit (Bewilligungen R01 GM67167, R01 GM41628) und im Medizinischen Forschungsfond Helens Nelson an der Größeren Kansas City-GemeinschaftsBasis finanziert.

QuellThe Scripps Research Institute

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