TSRI sviluppa la mappa strutturale accurata dei commputer molecolari complessi in celle

Published on June 6, 2014 at 9:29 AM · No Comments

Un gruppo piombo dai ricercatori al The Scripps Research Institute (TSRI) ha usato le tecniche avanzate di microscopia elettronica per determinare la prima mappa strutturale accurata del Mediatore, uno di più grandi e maggior parte “di commputer molecolari„ complessi in celle.

Il Mediatore è cruciale per il regolamento della maggior parte della attività dei geni e lavora nelle celle di tutti i piante ed animali. La mappatura del suo struttura-che include più di due dozzina proteine uniche sottounità-rappresentano uno sviluppo significativo della biologia cellulare di base e dovrebbero fare luce sulle condizioni mediche che comprendono la disfunzione del Mediatore, da cancro ai disordini inerenti allo sviluppo ereditati.

L'individuazione dimostra come i metodi molecolari sviluppati di recente della rappresentazione possono applicarsi per caratterizzare i grandi e complessi importanti della proteina.

“Potere determinare come questi grandi commputer molecolari guardano, come sono organizzati e come si muovono, sarà critico per una migliore comprensione di molti trattamenti chiave in celle,„ ha detto il Professore Associato Francisco il J. Asturie, l'autore senior di TSRI dello studio, che è stato pubblicato il 5 giugno 2014 dalla Cella del giornale.

Un Commputer Complesso

La mappa dettagliata del Mediatore viene quasi 20 anni dopo il complesso in primo luogo è stata descritta dal biologo Roger Kornberg di Stanford University e dai colleghi. Kornberg, di cui i membri del laboratorio allora hanno incluso le Asturie, più successivamente ha estratto un Premio Nobel per il suo lavoro sul macchinario della trascrizione del gene delle celle.

Questo macchinario della trascrizione del gene si è evoluto per eseguire una delle funzioni più fondamentali e più sistematiche nella biologia, vale a dire la copiatura delle informazioni codificate nel DNA dei geni in RNA portatile “le trascrizioni„ - alcuni di cui soggiorno e lavoro nel nucleo delle cellule, mentre altre escono il nucleo e sono tradotte in proteine.

Ogni cella fa il suo proprio determinare reticolo di attività della trascrizione del gene, da un sistema di regolazione in cui il Mediatore svolge un ruolo indispensabile. Il complesso enorme del Mediatore permette ai fattori di trascrizione e ad altre proteine regolarici di influenzare il RNA polimerasi II che realmente esegue la trascrizione.

Per capire precisamente come il Mediatore fa il suo processo, gli scienziati hanno avuto bisogno di un modello 3-D accurato della sua architettura, compreso le posizioni di tutte le sue proteine dell'sottounità e una descrizione del Mediatore differente di conformazioni può adottare per influenzare le interazioni fra altre componenti del macchinario della trascrizione.

Tuttavia, il Mediatore è enorme dagli standard biologici: la versione trovata in lievito ha 25 sottounità distinti della proteina e la versione umana ha 30. È egualmente altamente flessibile. Quella combinazione di grande, alta complessità e di alta flessibilità le rende un candidato povero per i metodi di alta risoluzione della rappresentazione quali Cristallografia a raggi x o la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare.

Come ricercatore postdottorale nel laboratorio di Kornberg negli anni 90, le Asturie hanno aiutato il pioniere l'uso “di microscopia elettronica della singola particella„ (EM) per la rappresentazione di grandi complessi della trascrizione quale il Mediatore. il EM della Unico Particella richiede la cattura di migliaia di immagini separate di EM di una particella delle immagini “rumorose„ di interesse-tipico molto, che descrivono una particella negli orientamenti differenti e forse egualmente in una serie di conformazioni differenti. Tutti questi dati devono essere filtrati e fatti la media per diminuire il disturbo e per rendere le maschere 3-D utili. In uno studio 1999 nella Scienza, le Asturie ed i colleghi hanno usato un modulo in anticipo del EM della unico particella per determinare la prima struttura approssimativa del complesso completo del Mediatore.

A Metà la decade e da allora, il gruppo delle Asturie ha continuato ad usare le tecniche di EM per studiare il Mediatore. Altri hanno usato le tecniche ad alta definizione per studiare i diversi sottounità del Mediatore o parti del complesso. Tuttavia, una chiara e maschera accurata di come le intere misure della struttura è stata insieme evasive finora.

Giro del Modello sulla sua Testa

Per determinare chiaramente la struttura completa, le Asturie ed i suoi colleghi hanno cominciato producendo le quantità altamente pure di versione standard del lievito del trattamento di depurazione del Mediatore- stessa che è una sfida importante. Poi hanno usato questa raccolta delle particelle del Mediatore per registrare approssimativamente 85.000 immagini di EM, che hanno categorizzato secondo conformazione. Fare La Media questi ha reso il più chiaro modello 3D eppure della struttura del Mediatore, ad una risoluzione di circa 18 Angstrom (1,8 billionths di un metro).

Facendo Uso di varie analisi biochimiche, compreso la sottrazione degli sottounità differenti della proteina per vedere come le immagini di EM variabili, gli scienziati potevano identificare le posizioni precise degli sottounità della proteina del Mediatore 25 del lievito.

Ciò mappare provocata una revisione completa di vecchio modello approssimativo della struttura della testa-medio-coda del Mediatore. “Dopo Che abbiamo individuato tutti gli sottounità della proteina, abbiamo rend contoere che il modulo capo è alla cima del Mediatore, non il fondo come avuto stato pensiero,„ ha detto Kuang-Lei Tsai, un collega postdottorale nel Laboratorio delle Asturie, che era primo autore dello studio. “Questi nuovi dati ci hanno aiutati ad avere significato di molte osservazioni biochimiche precedenti.„

Le Asturie e Tsai dopo hanno collaborato con il laboratorio di Joan e Ron Conaway-Joan è un altro Kornberg alunno-all'Istituto di Stowers per Ricerca Medica in Kansas City. Il gruppo di Conaway stava lavorando al Mediatore umano ed ai campioni puri ora forniti per la rappresentazione di EM come pure alle analisi biochimiche delle posizioni dell'sottounità.

Questo lavoro ha rivelato che il Mediatore umano divide la stessa vasta architettura, implicante che questa struttura, generalmente, fosse stata conservata durante i miliardo anni di evoluzione che separano il lievito e gli esseri umani. “I due Mediatori hanno Basicamente simile struttura globale,„ ha detto Tsai.

Nell'ultima parte dello studio, le Asturie e Tsai hanno usato i nuovi dati strutturali per mostrare come il Mediatore probabilmente cambia la sua conformazione mentre interagisce con il RNA polimerasi da un lato ed i vari regolatori della trascrizione d'altro canto.

“Questo studio ci ha dato una maschera equo definitiva dell'architettura del Mediatore e come gli sottounità differenti sono organizzati, in modo da noi può cominciare lavorare verso un modello atomico di risoluzione,„ le Asturie hanno detto. “Egualmente vogliamo capire meglio come il Mediatore interagisce con tutte quelle altre proteine realmente per effettuare la trascrizione in un modo regolamentato.„

Oltre alle Asturie, Tsai e Joan e Ron Conaway, i co-author dello studio, “l'Architettura dell'Sottounità e le Riorganizzazioni Modulari Funzionali del Complesso Trascrizionale del Mediatore,„ erano Chieri Tomomori-Sato e Shigeo Sato, anche dell'Istituto di Stowers per Ricerca Medica.

La ricerca è stata costituita un fondo per in parte dagli Istituti della Sanità Nazionali (concessioni R01 GM67167, R01 GM41628) ed il Fondo di Ricerca Medica di Helen Nelson alle Maggiori Fondamenta della Comunità di Kansas City.

The Scripps Research Institute di Sorgente

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