TSRI desenvolve o mapa estrutural exacto de máquinas moleculars complexas nas pilhas

Published on June 6, 2014 at 9:29 AM · No Comments

Uma equipe conduzida por pesquisadores no The Scripps Research Institute (TSRI) usou técnicas avançadas da microscopia de elétron para determinar o primeiro mapa estrutural exacto do Mediador, uma “de máquinas moleculars as maiores e a maioria complexas” nas pilhas.

O Mediador é crucial para o regulamento da maioria de actividade de genes e trabalha nas pilhas de todos os vegetais e animal. O traço do seu estrutura-que inclui mais de dois dúzia proteínas originais subunidade-representam um avanço significativo na biologia celular básica e devem derramar a luz nos problemas médicos que envolvem a deficiência orgânica do Mediador, do cancro às desordens desenvolventes herdadas.

Encontrar demonstra como os métodos moleculars recentemente desenvolvidos da imagem lactente podem ser aplicados para caracterizar grandes e complexos importantes da proteína.

“Poder determinar como estas grandes máquinas moleculars olham, como são organizadas e como se movem, será crítico para uma compreensão melhor de muitos processos chaves nas pilhas,” disse o Professor Adjunto Francisco J. as Astúrias de TSRI, autor superior do estudo, que foi publicado o 5 de junho de 2014 pela Pilha do jornal.

Uma Máquina Complexa

O mapa detalhado do Mediador vem quase 20 anos após o complexo foi descrito primeiramente pelo biólogo Roger Kornberg da Universidade de Stanford e pelos colegas. Kornberg, cujos os membros do laboratório incluíram naquele tempo as Astúrias, ganhou mais tarde um Prémio Nobel para seu trabalho na maquinaria da transcrição do gene das pilhas.

Esta maquinaria da transcrição do gene evoluiu para executar uma das funções as mais básicas e as mais rotineiras na biologia, a saber o copi da informação codificada no ADN dos genes no RNA portátil “transcritos” - alguns de que estada e trabalho no núcleo de pilha, quando outro retirar o núcleo e é traduzida em proteínas.

Cada pilha tem seu próprio teste padrão da actividade da transcrição do gene, determinado por um sistema regulador em que o Mediador joga um papel indispensável. O complexo enorme do Mediador permite factores da transcrição e outras proteínas reguladoras de influenciar a polimerase de RNA II que executa realmente a transcrição.

Para compreender precisamente como o Mediador faz seu trabalho, os cientistas têm necessário um modelo 3-D exacto de sua arquitetura, incluindo os lugar de todas suas proteínas da subunidade e uma descrição do Mediador diferente das conformações pode adotar para influenciar interacções entre outros componentes da maquinaria da transcrição.

Contudo, o Mediador é enorme por padrões biológicos: a versão encontrada no fermento tem 25 subunidades distintas da proteína e a versão humana tem 30. É igualmente altamente flexível. Essa combinação de grande tamanho, de complexidade alta e de flexibilidade alta faz-lhe um candidato deficiente para métodos de alta resolução da imagem lactente tais como o cristalografia do Raio X ou a espectroscopia da ressonância magnética nuclear.

Como um pesquisador pos-doctoral no laboratório de Kornberg nos anos 90, as Astúrias ajudaram o pioneiro o uso da “da microscopia de elétron única partícula” (EM) para a imagem lactente de grandes complexos da transcrição tais como o Mediador. o EM da Único-Partícula exige a tomada dos milhares de imagens separadas do EM de uma partícula das imagens “ruidosas” do interesse-típico muito, que descrevem uma partícula em orientações diferentes e talvez igualmente em um número de conformações diferentes. Todos estes dados devem ser filtrados e calculado a média para reduzir o ruído e para render imagens 3-D úteis. Em um estudo 1999 na Ciência, as Astúrias e os colegas usaram um formulário adiantado do EM da único-partícula para determinar a primeira estrutura áspera do complexo completo do Mediador.

Ao a década e meio desde então, o grupo das Astúrias continuou a usar técnicas do EM para estudar o Mediador. Outro usaram técnicas de alta resolução para estudar subunidades do Mediador ou parcelas individuais do complexo. Contudo, uma imagem clara e exacta de como os ajustes inteiros da estrutura junto foram indescritíveis até aqui.

Girando um Modelo em sua Cabeça

Para determinar claramente a estrutura completa, as Astúrias e seus colegas começaram produzindo as quantidades altamente puras de uma versão padrão do fermento do processo da purificação do Mediador- próprias que é um desafio principal. Usaram então esta coleção de partículas do Mediador para gravar aproximadamente 85.000 imagens do EM, que categorizaram de acordo com a conformação. Calcular A Média destes rendeu o modelo 3D o mais claro contudo da estrutura do Mediador, a uma definição de aproximadamente 18 Ångströms (1,8 billionths de um medidor).

Usando as várias análises bioquímicas, incluindo a subtracção de subunidades diferentes da proteína para ver como as imagens do EM mudadas, os cientistas podiam identificar os lugar precisos de subunidades da proteína do Mediador 25 do fermento.

Isto traço conduzido a uma revisão detalhada do modelo áspero velho da estrutura da cabeça-médio-cauda do Mediador. “Depois Que nós encontramos todas as subunidades da proteína, nós realizamos que o módulo principal está na parte superior do Mediador, não a parte inferior como tido sido pensamento,” disse Kuang-Leus Tsai, um companheiro pos-doctoral no Laboratório das Astúrias, que era primeiro autor do estudo. “Estes dados novos ajudaram-nos a fazer o sentido de muitas observações bioquímicas precedentes.”

As Astúrias e Tsai em seguida colaboraram com o laboratório de Joana e Ron Conaway-Joana é um outro Kornberg aluno-no Instituto de Stowers para a Investigação Médica em Kansas City. A equipe de Conaway tem trabalhado no Mediador humano e em amostras puras agora fornecidas para a imagem lactente do EM, assim como em análises bioquímicas dos lugar da subunidade.

Este trabalho revelou que o Mediador humano compartilha da mesma arquitetura larga, implicando que esta estrutura, estêve conservada geralmente ao longo dos bilhão anos de evolução que separa o fermento e os seres humanos. “Basicamente os dois Mediadores têm a estrutura total similar,” disse Tsai.

Na última parte do estudo, as Astúrias e Tsai usaram os dados estruturais novos para mostrar como o Mediador muda provavelmente sua conformação como interage com a polimerase de RNA de um lado, e vários reguladores da transcrição nos outro.

“Este estudo deu-nos uma imagem razoavelmente definitiva da arquitetura do Mediador e como as subunidades diferentes são organizadas, assim que nós pode começar trabalhar para um modelo atômico da definição,” as Astúrias disseram. “Nós igualmente queremos compreender melhor como o Mediador interage com todas aquelas proteínas restantes para realizar realmente a transcrição em uma maneira regulada.”

Além do que as Astúrias, Tsai e Joana e Ron Conaway, os co-autores do estudo, da “a Arquitetura Subunidade e os Rearranjos Modulares Funcionais do Complexo Transcricional do Mediador,” eram Chieri Tomomori-Sato e Shigeo Sato, também do Instituto de Stowers para a Investigação Médica.

A pesquisa foi financiada na parte pelos Institutos de Saúde Nacionais (concessões R01 GM67167, R01 GM41628) e no Fundo de Investigação Médica de Helen Nelson na Fundação Maior da Comunidade de Kansas City.

The Scripps Research Institute de Source

Read in | English | Español | Français | Deutsch | Português | Italiano | 日本語 | 한국어 | 简体中文 | 繁體中文 | Nederlands | Русский | Svenska | Polski