Os Cientistas projectam o sistema CRISPR-Cas9 o menor até agora

Os Cientistas no Centro para a Engenharia do Genoma, dentro do Instituto para a Ciência Básica (IBS), em colaboração com o Huno de KIM Eunji (ToolGen Inc.) e de KIM Jeong (Universidade de Nacional de Seoul) projectaram o CRISPR-Cas9 o menor até agora, entregaram-lhe às pilhas de músculo e nos olhos dos ratos através dos vírus adeno-associados (AAV) e usaram-se lhe para alterar um gene que causa a cegueira. Publicado em Comunicações da Natureza, este sistema CRISPR-Cas9, originado do jejuni do Campylobacter (CjCas9), é esperado transformar-se uma ferramenta terapêutica útil contra a terra comum e alvos “undruggable” da doença.

CRISPR-Cas9 é a buzzword entre biólogos moleculars. É um inovativo, barato e técnica precisa para editar genes. Cas9 é o “gene scissors” a proteína: Cria cortes no gene do alvo nos lugar precisos indicados pelo RNA do guia. Para que o complexo CRISPR-Cas9 alcance o ADN do alvo, tem que ser entregado através dos plasmídeo ou dos vírus. “AAV é um vector eficiente e seguro expressar in vivo um gene do interesse e foi usado extensamente na terapia genética,” explica KIM Jin-Soo, director do Centro de IBS para a Engenharia do Genoma e do autor correspondente do estudo. Naturalmente, Cas9 é usado por diversas bactérias como uma arma da imunidade; é necessário cortar o ADN viral que poderia danificar as bactérias. A versão a mais comum da técnica CRISPR-Cas9 usa Cas9 derivado do Estreptococo da bactéria - pyogenes. Contudo, esta proteína é feita de 1.368 ácidos aminados e é demasiado grande ser entregada e empacotado em AAV. Mesmo se os cientistas a racharam acima em duas porções, cada um empacotou em um vírus diferente, outras edições elevara: Uma quantidade dobro de vírus precisa de ser entregada e a separação Cas9 é menos activa do que o SpCas9 intacto. Estafilococo - Cas9 áureo é usado igualmente para a edição do gene. É ligeira menor (1.053 ácidos aminados), de modo que possa apenas caber dentro do AAV, mas não deixa bastante espaço para outras proteínas.

Neste estudo, a equipe encontrou que CjCas9 é eficiente e pequeno. Tem 984 ácidos aminados e pode ser embalado em AAV junto com mais de um guia RNAs assim como com uma proteína fluorescente do repórter.

A fim usar uma proteína bacteriana para o gene que edita, os cientistas tiveram que aperfeiçoar alguns aspectos da técnica. Projectaram uma seqüência curto do ADN imediatamente depois da seqüência do ADN visada pelo Cas9, chamado Protospacer Motivo Adjacente (PAM). Cada Cas9 diferente precisa uma seqüência específica do PAM, se não não poderá ligar a e fender a seqüência do ADN do alvo. Em Segundo Lugar, tiveram que alterar o comprimento do RNA do guia.

Mais Tarde, os cientistas de IBS empacotaram o complexo CRISPR-Cas9 novo em AAV, junto com dois o guia RNAs e uma proteína fluorescente do repórter, para transformar genes nos músculos e nos olhos dos ratos. Concentraram-se em dois genes envolvidos na degeneração macular relativa à idade (AMD), uma das causas de condução da cegueira nos adultos. Um gene é um alvo terapêutico comum para ADM, chamado o factor de crescimento endothelial Vascular A (VEGF A), outro é um factor da transcrição que active o transcripction de VEGF A e sabe-se como HIF-1a. Ao Contrário de VEGF A, HIF-1a não foi considerado como um alvo da droga. So-called'undruggable'genes, tal como a transcrição fatora geralmente, não pode ser visado directamente por anticorpos e por outras drogas biológicas ou químicas. Neste estudo, a equipa de investigação mostrou que CjCas9 entregado à retina através de AAV pode neutralizar Hif1a e VEGF A nos ratos eficientemente e reduziu a área do neovascularization choroidal (CNV).

As injecções Intraocular de CRISPR-CjCas9 AAV-empacotado podiam ser benéficas tratar várias doenças retinas e doenças sistemáticas. “CjCas9 é altamente específico e não causa mutações do fora-alvo no genoma,” explica KIM Jin-Soo.

As seqüências do alvo do gene de Hif1a estão as mesmas em ambos os ratos e os seres humanos, desse modo o método apresentado neste estudo poderiam ser usados no futuro para o tratamento de ADM em pacientes humanos. Pavimentando a maneira à aplicação de CjCas9 contra genes “undruggable” ou seqüências da não-codificação, esta tecnologia pode alargar a escala de alvos terapêuticos, fazendo o genoma humano inteiro potencial druggable.

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