Forskare iscensätter det minsta systemet CRISPR-Cas9 hitintills

Forskare på Centrera för Genom som Iscensätter, inom Institutet för Grundläggande Vetenskap (IBS), i samarbete med den KIM Eunji (ToolGen Inc.) och KIM Jeong Hunen (Seoul MedborgareUniversitetar) har iscensatt den minsta CRISPRen-Cas9 hitintills, levererat det till muskelcellerna och i synar av möss via adeno-tillhörande virus (AAV) och som använder det för att ändra en gen orsaka blindness. Publicerat på NaturKommunikationer, förväntas detta system som CRISPR-Cas9 påbörjas från Campylobacterjejunien (CjCas9), för att bli ett användbart terapeutiskt bearbetar mot allmänning, och ”uppsätta som mål den undruggable” sjukdomen.

CRISPR-Cas9 är modeordet amongst molekylära biologer. Det är ett innovativt, en billigt pris och preciserar teknik för att redigera gener. Cas9 är ”genen scissors” protein: Den skapar snitt på uppsätta som målgenen preciserar in lägen som indikeras av vägledaRNAEN. För att komplex CRISPR-Cas9 som ner uppsätta som målDNAEN, måste den att levereras via plasmids eller virus. ”Är AAV ett effektivt, och kassaskåpvektorn till uttryckligt en gen av intresserar in - vivo och har använts brett i genterapi,” förklarar KIM Jin-Soo, Centrerar direktören av IBSEN för den Iscensätta och motsvarande författare för Genom av studien. Naturligt används Cas9 av flera bakterier som ett immunitetvapen; den är nödvändig att klippa virus- DNA som kunde skada bakterierna. Den mest allmänningversionen av tekniken CRISPR-Cas9 använder Cas9 som härledas från bakterieStreptococcusen - pyogenes. Emellertid göras detta protein av 1.368 aminoacids, och det är för stort att levereras och paketeras i AAV. Om Även forskare delar det upp in i två delar, paketerade varje i en olik virus, annan utfärdar uppstår: Ett dubbelt belopp av virus behöver att levereras, och splittringen Cas9 är mindre aktiv än den intakt SpCas9en. Staphylococcus - aureus Cas9 används också för att redigera för gen. Den är litet mindre (1.053 aminoacids), så att den kan precis färdig insida AAVEN, men lämnar inte nog utrymme för andra proteiner.

I denna studie grundar laget att CjCas9 är både effektiv och liten. Den har 984 aminoacids, och den kan packas i AAV samman med mer, än en vägleder RNAs såväl som med ett fluorescerande reporterprotein.

För att använda ett bakterie- protein för genen som redigerar måste forskare att optimera några aspekter av tekniken. De planlade en kort stavelseDNA ordnar DNAEN ordnar omgående efter riktat vid Cas9en som kallades Protospacer det Närgränsande Motiv (PAM). Varje olik Cas9 behöver en närmare detaljPAM ordnar, annorlunda ska den för att inte vara kompetent till röran till, och att klyva uppsätta som målDNAEN ordna. Secondly måste de att ändra längden av vägledaRNAEN.

Därefter paketerade IBS-forskare det nya komplex CRISPR-Cas9 in i AAV, samman med två vägleder RNAs och ett fluorescerande reporterprotein, för att mutera gener i möss muskler och synar. De koncentrerade på två gener som var involverade i densläkta macular försämringen (AMD), en av leda orsakar av blindness i vuxen människa. En gen är en terapeutisk allmänning uppsätta som mål för ADM, kallad Kärl- som endothelial tillväxt dela upp i faktorer A (VEGF A), annan, är en transkription dela upp i faktorer som aktiverar transcripctionen av VEGF A, och den är bekant som HIF-1a. I Motsats Till VEGF A, har HIF-1a inte varit ansedd, som en drog uppsätta som mål. So-called'undruggable'genes liksom transkription dela upp i faktorer i allmänhet, kan inte uppsätta som mål direkt av antikroppar och andra biologiska eller kemiska droger. I denna studie bevisade förminskade forskninglaget, att CjCas9 som levereras till näthinnan via AAV kan inactivate Hif1a och VEGF A i möss effektivt och området av den choroidal neovascularizationen (CNV).

Intraocular injektionar av AAV-paketerad CRISPR-CjCas9 kunde vara välgörande till olika retinal sjukdomar för fest och systemic sjukdomar. ”Är orsakar CjCas9 högt specifik och inte av-uppsätta som mål mutationar i genom,” förklarar KIM Jin-Soo.

Hif1a-genen uppsätta som mål ordnar är samma i båda möss, och människor, därmed metoden som framlades i denna studie, kunde användas i framtiden för behandlingen av ADM i människatålmodig. Genom att stenlägga långt till applikationen av CjCas9 mot ”undruggable” gener eller non-att kodifiera, ordnar, denna teknologi kan bredda spänna av terapeutiskt uppsätta som mål, danande hela den potentiellt druggable människagenom.

Källa: http://www.ibs.re.kr/cop/bbs/BBSMSTR_000000000738/selectBoardArticle.do?nttId=14255

Advertisement