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Un'analisi sensibile di Pseudovirus per la schermatura degli anticorpi SARS-CoV-2

La sicurezza e la versatilità degli pseudoviruses come strumenti virologici hanno supportato il loro uso nella valutazione l'efficacia e della sicurezza dei vaccini e degli agenti terapeutici contro il coronavirus novello 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo.

SARS-CoV-2

SARS-CoV-2. Credito di immagine: Kateryna Kon/Shutterstock.com

Vantaggi di un sistema di pseudovirus

Pseudoviruses è strumenti eccellenti per studiare il romanzo ed i virus altamente patogeni che richiederebbero altrimenti gli impianti del laboratorio di un livello elevato di sicurezza biologica (BSL) di 3 o di 4. oltre ad evitare l'esposizione ai virus altamente contagiosi, il sistema di pseudovirus egualmente è associato con parecchi vantaggi compreso produzione e facilità rapide di quantificazione.

Ancora, i virus della progenie sono soltanto capaci di subire un singolo ciclo della replica, quindi avanzano il supporto della sicurezza di questo sistema.

Che cosa sono pseudoviruses?

Pseudoviruses è fatto dalle componenti che sono provenuto da due virus differenti. La componente di superficie della glicoproteina proviene dal virus destinato allo studio, mentre il genoma di memoria interna è derivato tipicamente da un virus di vesiculo o dal virus.

Alcuni esempi dei virus che sono stati usati per fornire il genoma di memoria interna per la generazione di pseudoviruses SARS-CoV-2 comprendono il virus vescicolare del virus di stomatite vescicolare (VSV) come pure vari retrovirses compreso il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), il virus murino di leucemia (MLV) ed il virus felino di leucemia (FLV).

Il sistema di pseudovirus per ricerca

Fin qui, basato pseudovirus il genoma di memoria di uno pseudovirus è alterato in moda da cancellare le proteine del virus responsabili della facilitazione della replica, compreso la glicoproteina indigena. Invece, la proteina-codifica del reporter per un enzima, quali il luciferase, o un altro tipo di proteina fluorescente è compresa.

Pseudoviruses, quindi, infetta soltanto una volta le celle suscettibili e non può subire ulteriore replica. Tuttavia, sopra l'infezione di pseudovirus, la proteina del reporter è espressa con un'attività che può essere quantificata sensibile come stata necessaria.

Per la riuscita infezione di pseudovirus, le celle devono esprimere i ricevitori pertinenti che legano la glicoproteina di superficie per permettere l'entrata di pseudovirus e. Tenendo conto l'infezione di uno pseudovirus può quindi fornire le vie virali appropriate dell'entrata che sono necessarie studiare il virus contagioso di interesse.

Sfide nello studio del SARS-CoV-2

Nel dicembre 2019 un coronavirus novello conosciuto come SARS-CoV-2 è provenuto a Wuhan, Cina e successivamente si è sparso in tutto il globo con conseguente pandemia di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19). dovuto la natura altamente patogena ed ereditaria di SARS-CoV-2, linee guida di CDC raccomandi che tutto il lavoro di laboratorio effettuato con SARS-CoV-2 debba essere realizzato ad un livello elevato di sicurezza biologica di BSL-3 o di -4.

Tuttavia, entrambi i BSL-3 e -4 laboratori sono limitati ad alcune istituzioni. Questa limitazione limita la prova su grande scala dell'efficacia dei vaccini e gli anticorpi monoclonali terapeutici mirati a contro SARS-CoV-2 chiodano (s) la glicoproteina. Un'alternativa sarebbe di impiegare gli pseudoviruses di SARS-CoV-2 S.

Sistemi di Pseudovirus per lo studio del SARS-CoV-2

Dall'emergenza di SARS-CoV-2, vari ad approcci basati pseudovirus sono stati utilizzati per studiare questa malattia e per valutare l'efficacia di determinati agenti terapeutici. In uno studio recente, ad un'analisi basata pseudovirus di neutralizzazione (PBNA) è stata sviluppata per confrontare la neutralizzazione di determinati anticorpi con SARS-CoV-2.

Brevemente, il sistema di VSV è stato usato e confermato stato per video la proteina della punta SARS-CoV-2 sulla superficie della particella di VSV con l'analisi della Occidentale-macchia. /Once il virus pseudotyped S SARS-CoV-2 è generato stato, complessivamente settantaquattro umani e quarantasei campioni del siero del mouse sono provato stati per valutare la specificità dell'analisi.

Il limite di rilevazione per questa analisi è stato trovato per essere 22,1 per i campioni umani e 43,2 per i campioni del mouse, con i valori di taglio fissati come 30 e 50 per i campioni del mouse e dell'essere umano, rispettivamente. Catturata insieme, questa analisi è stata trovata per avere variazioni basse di coefficiente rispetto a 15,9% per l'analisi di intra-analisi e a 16,2% per l'analisi di inter analisi.

Neerukonda ed i colleghi egualmente hanno sviluppato un'analisi altamente sensibile che impiega gli pseudoviruses di SARS-CoV-2 S per la schermatura il siero o del plasma dai pazienti COVID-19 e dalle persone vaccinate come pure valuta l'efficacia degli anticorpi monoclonali terapeutici. In questo studio pubblicato in PlosOne, i ricercatori hanno stabilito i reagenti di pseudovirus e delle cellule che producono gli alti rendimenti ed infezione di pseudovirus per facilitare la selezione massiccia del disgaggio degli anticorpi e degli inibitori dell'entrata contro COVID-19.

Per confermare l'utilità di questa analisi della selezione, i ricercatori hanno usato una linea cellulare stabile 293T che esprime l'enzima di conversione dell'angiotensina umano 2 (ACE2) e la proteasi 2 (TMPRSS2) della serina del transmembrane. L'associazione della proteina di S sulla superficie di SARS-CoV-2 al ricevitore ACE2 delle celle media l'entrata di questo virus nelle cellule bersaglio come pure catalizza la fusione del virale e delle membrane cellulari. TMPRSS2 come pure i cathepsins B e L, sono egualmente critici per l'entrata efficiente di SARS-CoV-2 nelle celle, specialmente all'interno delle celle epiteliali dei polmoni.

Considerevolmente, questa è un'analisi HIV basata che è stata trovata per essere più vantaggiosa di VSV in termini di tempo richiesto per generare gli pseudoviruses (2 giorni contro 5-6 giorni) e per condurre la selezione. Questo SARS-CoV-2 PBNA lentiviral ed i sui reagenti corrente sta usando dai ricercatori e dalle agenzie di salute pubblica universalmente ad un disgaggio straordinario per confrontare il potenziale di neutralizzazione dalle delle risposte immunitarie indotte da vaccino con le varianti esistenti ed emergenti SARS-CoV-2.

Riferimenti:

  • Neerukonda, S.N., Vassell, R., Herrup, R., et al. (2021). Istituzione di un'analisi lentiviral ben-caratterizzata di neutralizzazione di pseudovirus SARS-CoV-2 facendo uso delle celle 293T con l'espressione stabile di ACE2 e di TMPRSS2. Doi 16 di PLOS UNO.: 10.1371/journal.pone.0248348.
  • Huang, S., Tai, C., Hsu, Y., et al. (2020). Valutazione dell'applicazione di un sistema di pseudovirus per SARS-CoV-2 emergente e riapparire i sottotipi del virus di influenza aviaria H5 in via di sviluppo lo sviluppo del vaccino. Giornale biomedico 43(4); 375-387. doi: 10.1016/j.bj.2020.06.003.
  • Nie, J., Li, Q., Wu, J., et al. (2020). Istituzione e convalida di un'analisi di neutralizzazione di pseudovirus per SARS-CoV-2. Microbi emergenti & infezioni 9(1); 680-686. doi: 10.1080/22221751.2020.1743767.

Last Updated: Apr 26, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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