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Um ensaio sensível de Pseudovirus para selecionar os anticorpos SARS-CoV-2

A segurança e a versatilidade dos pseudoviruses como ferramentas virological apoiaram seu uso em avaliar a eficácia e a segurança das vacinas e de agentes terapêuticos contra o coronavirus novo 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2).

SARS-CoV-2

SARS-CoV-2. Crédito de imagem: Kateryna Kon/Shutterstock.com

Vantagens de um sistema do pseudovirus

Pseudoviruses é ferramentas excelentes para estudar a novela e os vírus altamente patogénicos que exigiriam de outra maneira facilidades do laboratório de um nível mais alto da seguridade biológica (BSL) de 3 ou de 4. além do que a evitação da exposição aos vírus altamente contagiosos, o sistema do pseudovirus são associados igualmente com diversas vantagens que incluem a produção e a facilidade rápidas da quantificação.

Além disso, os vírus da descendência são somente capazes de submeter-se um único ciclo da réplica, promovem desse modo o apoio da segurança deste sistema.

Que são pseudoviruses?

Pseudoviruses é feito dos componentes que originaram de dois vírus diferentes. O componente de superfície da glicoproteína é do vírus pretendido para o estudo, visto que o genoma do núcleo interno é derivado tipicamente de um vírus do vesiculo ou do vírus.

Alguns exemplos dos vírus que foram usados para fornecer o genoma do núcleo interno para a geração dos pseudoviruses SARS-CoV-2 incluem o vírus vesicular do vírus do stomatitis vesicular (VSV), assim como diversos retrovirses diferentes que incluem o vírus de imunodeficiência humana (HIV), o vírus murine da leucemia (MLV), e o vírus felino da leucemia (FLV).

O sistema do pseudovirus para a pesquisa

Até agora, pseudovirus-baseado o genoma do núcleo de um pseudovirus é alterado de modo que as proteínas do vírus responsáveis para facilitar a réplica, incluindo a glicoproteína nativa, sejam suprimidas. Em lugar de, uma proteína-codificação do repórter para uma enzima, tal como o luciferase, ou um outro tipo de proteína fluorescente é incorporada.

Pseudoviruses, contamina conseqüentemente pilhas suscetíveis somente uma vez e não pode submeter-se a uma réplica mais adicional. Contudo, em cima da infecção do pseudovirus, a proteína do repórter é expressada com uma actividade que possa sensìvel ser determinada como necessário.

Para a infecção bem sucedida do pseudovirus, as pilhas devem expressar os receptors pertinentes que ligam a glicoproteína de superfície para permitir a entrada do pseudovirus e. Permitir a infecção de um pseudovirus pode conseqüentemente fornecer os caminhos virais apropriados da entrada que são necessários estudar o vírus contagioso do interesse.

Desafios em estudar SARS-CoV-2

Em dezembro de 2019 um coronavirus novo conhecido como SARS-CoV-2 originou em Wuhan, China, e espalhou subseqüentemente durante todo o globo tendo por resultado uma pandemia da doença 2019 do coronavirus (COVID-19). Devido à natureza altamente patogénico e transmissível de SARS-CoV-2, directrizes do CDC recomende que todo o trabalho de laboratório realizado com SARS-CoV-2 deve ser executado a nível mais alto da seguridade biológica de BSL-3 ou de -4.

Contudo, ambos os BSL-3 e -4 laboratórios são limitados a algumas instituições. Esta limitação restringe o teste em grande escala da eficácia das vacinas e os anticorpos monoclonais terapêuticos visados contra SARS-CoV-2 cravam (s) a glicoproteína. Uma alternativa seria empregar pseudoviruses de SARS-CoV-2 S.

Sistemas de Pseudovirus para estudar SARS-CoV-2

Desde a emergência de SARS-CoV-2, diversas aproximações pseudovirus-baseadas diferentes foram utilizadas para estudar esta doença e para avaliar a eficácia de determinados agentes terapêuticos. Em um estudo recente, um ensaio pseudovirus-baseado da neutralização (PBNA) foi desenvolvido para avaliar a neutralização de determinados anticorpos contra SARS-CoV-2.

Momentaneamente, o sistema de VSV foi usado e confirmado para indicar a proteína do ponto SARS-CoV-2 na superfície da partícula de VSV com a análise da Ocidental-mancha. /Once o vírus SARS-CoV-2 pseudotyped S foi gerado, um total de seventy-four humanos e quarenta e seis amostras do soro do rato foram testadas para avaliar a especificidade do ensaio.

O limite de detecção para este ensaio foi encontrado para ser 22,1 para as amostras humanas e 43,2 para as amostras do rato, com os valores da interrupção ajustados como 30 e 50 para amostras do ser humano e do rato, respectivamente. Tomado junto, este ensaio foi encontrado para ter baixas variações do coeficiente com os 15,9% para a análise do intra-ensaio e os 16,2% para a análise do inter-ensaio.

Neerukonda e os colegas igualmente desenvolveram um ensaio altamente sensível que empregasse pseudoviruses de SARS-CoV-2 S para selecionar o soro ou o plasma dos pacientes COVID-19 e dos indivíduos vacinados, assim como avaliasse a eficácia de anticorpos monoclonais terapêuticos. Neste estudo publicado em PlosOne, os pesquisadores estabeleceram os reagentes da pilha e do pseudovirus que produzem rendimentos e a infecção altos do pseudovirus para facilitar a selecção maciça da escala dos anticorpos e dos inibidores da entrada contra COVID-19.

Para confirmar o serviço público deste ensaio da selecção, os pesquisadores usaram uma linha celular 293T estável que expressasse a enzima deconversão humana 2 (ACE2) e o protease 2 do serine da transmembrana (TMPRSS2). O emperramento da proteína de S na superfície de SARS-CoV-2 ao receptor ACE2 das pilhas negocia a entrada deste vírus em pilhas de alvo, assim como catalisa a fusão das membranas virais e de pilha. TMPRSS2, assim como os cathepsins B e L, são igualmente críticos para a entrada eficiente de SARS-CoV-2 em pilhas, particularmente dentro das pilhas epiteliais dos pulmões.

Notàvel, este é um ensaio VIH-baseado que seja encontrado para ser mais vantajoso do que VSV em termos do tempo exigido para gerar os pseudoviruses (2 dias contra 5-6 dias) e para conduzir a selecção. Este SARS-CoV-2 PBNA lentiviral e seus reagentes está sendo usado actualmente por pesquisadores e por agências da saúde pública no mundo inteiro em uma escala extraordinária para avaliar o potencial de neutralização de respostas imunes vacina-induzidas contra as variações SARS-CoV-2 existentes e emergentes.

Referências:

  • Neerukonda, S.N., Vassell, R., Herrup, R., e outros (2021). Estabelecimento de um ensaio lentiviral bem-caracterizado da neutralização do pseudovirus SARS-CoV-2 usando as pilhas 293T com expressão estável de ACE2 e de TMPRSS2. Doi 16 de PLOS UM.: 10.1371/journal.pone.0248348.
  • Huang, S., TAI, C., Hsu, Y., e outros (2020). Avaliando a aplicação de um sistema do pseudovirus para SARS-CoV-2 emergente e reemirjindo subtipos do vírus de gripe das aves H5 na revelação vacinal. Jornal biomedicável 43(4); 375-387. doi: 10.1016/j.bj.2020.06.003.
  • Nie, J., Li, Q., Wu, J., e outros (2020). Estabelecimento e validação de um ensaio da neutralização do pseudovirus para SARS-CoV-2. Micróbios emergentes & infecções 9(1); 680-686. doi: 10.1080/22221751.2020.1743767.

Last Updated: Apr 26, 2021

Benedette Cuffari

Written by

Benedette Cuffari

After completing her Bachelor of Science in Toxicology with two minors in Spanish and Chemistry in 2016, Benedette continued her studies to complete her Master of Science in Toxicology in May of 2018. During graduate school, Benedette investigated the dermatotoxicity of mechlorethamine and bendamustine; two nitrogen mustard alkylating agents that are used in anticancer therapy.

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