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Amplification croisée multiple de déplacement

L'amplification croisée multiple de déplacement (MCDA) est une méthode d'amplification d'acide nucléique utilisée généralement pour l'ordonnancement unicellulaire d'entier-génome.

amplification croisée multiple de déplacement

Crédit d'image : https://www.researchgate.net/figure/The-principle-of-multiple-cross-displacement-amplification-The-schematic-showing-the_fig2_279965601

Quelle est amplification croisée multiple de déplacement ?

La méthode croisée multiple d'amplification (MCDA) de déplacement emploie les amorces et l'ADN polymérase faits au hasard pour amplifier la matrice circulaire d'ADN. L'ADN peut être amplifié plus de fois 10.000 dans quelques heures. Contrairement aux méthodes basées sur réaction (PCR) de réseau de polymérase pour l'amplification entière de génome, telle que l'amplification en chaîne par polymérase oligonucléotide-amorcée dégénérée (DOP-PCR), MCDA couvre le génome entier.

Cependant, à cause du procédé rapide d'amplification, MCDA peut introduire la polarisation séquence-dépendante d'amplification, qui n'est pas reproductible dans tout le génome de la cellule à la cellule.

MCDA est appliqué largement pour amplifier des quantités inférieures de matrices d'ADN en sciences légales. La méthode peut même amplifier les échantillons d'ADN qui sont endommagés ou contenir des variations stochastiques, ou les échantillons mélangés d'ADN. En outre, la méthode peut être employée pour trouver les agents pathogènes avec la spécificité et la sensibilité élevées.

Comment exécuter MCDA ?

La méthode est exécutée utilisant les amorces et l'ADN polymérase faits au hasard du phi29 bactériophage, qui a 3 un ′ inhérent du → 5 de ′ corriger sur épreuves l'activité d'exonucléase. Cette polymérase est associée au fonctionnement de processivity, de haute fidélité, et exceptionnel élevé de boucle de déplacement.

Dans MCDA isotherme, qui est une méthode multiple d'amplification de déplacement de boucle de séquences d'ADN, deux jeux d'amorce (le bon jeu et est parti du jeu) sont employés. Les amorces droites de jeu sont complémentaires à un brin d'ADN d'objectif, et les amorces gauches de jeu sont complémentaires au brin d'ADN opposé. Lors de l'hybridation à la séquence d'ADN d'objectif, le 5' des extrémités des amorces restent distal à la séquence d'ADN.

Une fonctionnalité unique de cette méthode est le déplacement des amorces pendant la réplication polymérase-assistée de la séquence d'ADN d'objectif. Le déplacement des amorces par la polymérase rend les boucles neuf reproduites procurables pour l'hybridation aux amorces.

Pour l'amplification d'entier-génome utilisant MCDA isotherme, un ensemble fait au hasard d'amorces est utilisé pour reproduire fait au hasard une partie d'ADN génomique. Comme résultat, beaucoup de copies superposantes du génome entier peuvent être produites dans une courte période.

Pour exécuter MCDA, la matrice d'ADN est premièrement dénaturée utilisant la chaleur (95°C) ou demande de règlement chimique. Pour l'amplification, les amorces faites au hasard grippent l'ADN dénaturé, suivi de synthèse d'ADN utilisant l'ADN polymérase phi29. En particulier, un total de 10 amorces (amorces de déplacement : 2 ; amorces de faisceau : 2 ; amorces d'amplification : 6) sont employés pour identifier et amplifier différentes parties de la séquence d'ADN d'objectif. L'état isotherme (60 - 65°C) requis pour MCDA peut être mis à jour par simplement utilisant un bain d'eau ou une chaufferette.

Le dépistage des produits d'amplification de MCDA est effectué par les biocapteurs transversaux nanoparticle basés sur de flux. Les biocapteurs transversaux de flux sont les dispositifs portatifs et sur papier où différents types de nanoparticles sont employés en tant que marques pour le dépistage rapide, robuste, et visuel des fragments d'ADN spécifiques. Des produits d'amplification marqués avec de l'isothiocyanate et la biotine de fluorescéine peuvent être trouvés par les biocapteurs transversaux de flux dans un délai de 2 mn.      

Quel est l'adoucissement multiple et les cycles boucler d'amplification (MALBAC) ?

Cette méthode est une combinaison d'amplification entière basée sur ACP de génome et amplification multiple de déplacement où des amorces faites au hasard contenant les balises courantes de séquence sont utilisées. Les amorces sont hybridées à la séquence d'ADN d'objectif, suivie de l'amplification basée sur réaction de déplacement isotherme de boucle de la séquence d'objectif utilisant l'ADN polymérase de déclaration provisoire (bacillus stearothermophilus).

Puisque les amorces contiennent les balises courantes de séquence, les copies récemment formées d'ADN contiennent également des séquences courantes aux extrémités. Ceci mène à la formation des amplicons en boucle bloquée et à la prévention de l'amplification répétée. Bien que cette méthode soit associée sensiblement à moins de polarisation d'amplification, l'amplification des séquences d'ADN avec les structures secondaires (boucles en épingle à cheveux) ne peut pas être possible avec cette méthode. En outre, l'ADN polymérase utilisé dans cette méthode a la fidélité inférieure, qui augmente le risque de résultats faussement positifs.  

Quels sont les avantages de MCDA ?

Comparé aux méthodes basées sur ACP conventionnelles d'amplification de l'ADN, MCDA vient avec beaucoup d'avantages. Par exemple, aucune information spécifique sur la séquence d'ADN d'objectif n'est exigée pour exécuter MCDA.

Les amorces faites au hasard de hexamer utilisées dans la méthode peuvent viser et amplifier n'importe quelle séquence d'ADN possible. Puisque l'ADN polymérase phi29 ne dissocie pas facilement, les produits MCDA-produits d'amplification sont généralement plus grands que cela produit par des méthodes basées sur ACP.

D'ailleurs, basé sur la capacité de l'ADN polymérase phi29 d'employer la circulaire bicaténaire ADN comme matrice, une méthode multiplier-amorcée d'amplification de cercle tournant a été développée, qui est considérée la technique la plus robuste pour amplifier les matrices circulaires d'ADN avec la taille diverse.

À cause de ces avantages, la méthode de MCDA est très utilisée pour le dépistage circulaire de génome viral, le génome viral nonculturable ordonnançant, le dépistage circulaire de plasmide, l'entier-génome ordonnançant, le génotypage unique de polymorphisme de nucléotide, et l'analyse neuve de metagenome.

Récent, le plasmide circulaire et le rendement d'amplification d'ADN génomique de MCDA a été amélioré grand en protégeant par fusible le domaine de C-terminal de l'ADN polymérase phi29 avec les domaines obligatoires d'ADN.

Sources

Last Updated: Oct 16, 2020

Dr. Sanchari Sinha Dutta

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Dr. Sanchari Sinha Dutta

Dr. Sanchari Sinha Dutta is a science communicator who believes in spreading the power of science in every corner of the world. She has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree and a Master's of Science (M.Sc.) in biology and human physiology. Following her Master's degree, Sanchari went on to study a Ph.D. in human physiology. She has authored more than 10 original research articles, all of which have been published in world renowned international journals.

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