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Amplificazione trasversale multipla di spostamento

L'amplificazione trasversale multipla di spostamento (MCDA) è un metodo di amplificazione dell'acido nucleico comunemente usato per l'ordinamento unicellulare del intero-genoma.

amplificazione trasversale multipla di spostamento

Credito di immagine: https://www.researchgate.net/figure/The-principle-of-multiple-cross-displacement-amplification-The-schematic-showing-the_fig2_279965601

Che cosa è amplificazione trasversale multipla di spostamento?

Il metodo trasversale multiplo di amplificazione (MCDA) di spostamento usa le mani di fondo e la DNA polimerasi casuali per ampliare il modello circolare del DNA. Il DNA può essere ampliato oltre la volta 10.000 in alcune ore. Contrariamente ai metodi basati a reazione (PCR) della catena della polimerasi per l'intera amplificazione del genoma, quale reazione a catena oligonucleotide-innescata degenerata della polimerasi (DOP-PCR), MCDA riguarda l'intero genoma.

Tuttavia, a causa del trattamento rapido di amplificazione, MCDA può introdurre la tendenziosità sequenza-dipendente di amplificazione, che non è riproducibile in tutto il genoma dalla cella alla cella.

MCDA è usato ampiamente per ampliare gli importi bassi dei modelli del DNA in scienze legali. Il metodo può anche ampliare i campioni del DNA che sono danneggiati o contenere le variazioni stocastiche, o i campioni misti del DNA. Inoltre, il metodo può essere usato per individuare gli agenti patogeni con l'alte specificità e sensibilità.

Come eseguire MCDA?

Il metodo è eseguito facendo uso delle mani di fondo e della DNA polimerasi casuali del phi29 dei fagi, che ha 3 un ′ inerente del → 5 del ′ correggere le bozze dell'attività di exonuclease. Questa polimerasi è associata con l'alto processivity, l'alta fedeltà e la funzione eccezionale di spostamento del filo.

In MCDA isotermico, che è un metodo multiplo di amplificazione di spostamento del filo di sequenze del DNA, due insiemi della mano di fondo (l'insieme di destra ed ha lasciato l'insieme) sono usati. Radrizzi le mani di fondo stabilite sono complementare ad un filo del DNA dell'obiettivo e le mani di fondo sinistre dell'insieme sono complementari al filo opposto del DNA. Sopra l'ibridazione alla sequenza del DNA dell'obiettivo, il 5' estremità delle mani di fondo rimane distale alla sequenza del DNA.

Una funzionalità unica di questo metodo è lo spostamento delle mani di fondo durante la replica polimerasi-mediata della sequenza del DNA dell'obiettivo. Lo spostamento delle mani di fondo dalla polimerasi mette a disposizione i fili recentemente ripiegati per l'ibridazione delle mani di fondo.

Per l'amplificazione del intero-genoma facendo uso di MCDA isotermico, un insieme casuale delle mani di fondo è utilizzato per ripiegare a caso una parte di DNA genomico. Di conseguenza, molte copie di sovrapposizione di intero genoma possono essere prodotte in un corto periodo.

Per eseguire MCDA, il modello del DNA in primo luogo è denaturato facendo uso del calore (95°C) o trattamento chimico. Per l'amplificazione, le mani di fondo casuali legano il DNA denaturato, seguito dalla sintesi del DNA facendo uso della DNA polimerasi phi29. Specialmente, complessivamente 10 mani di fondo (mani di fondo di spostamento: 2; mani di fondo di memoria: 2; mani di fondo di amplificazione: 6) è usato per riconoscere ed ampliare le parti differenti della sequenza del DNA dell'obiettivo. Lo stato isotermico (60 - 65°C) richiesto per MCDA può essere mantenuto da semplicemente facendo uso di un bagnomaria o di un radiatore.

La rilevazione dei prodotti di amplificazione di MCDA è effettuata ai dai biosensori laterali basati a nanoparticella di flusso. I biosensori laterali di flusso sono portatile, unità cartacee in cui i tipi differenti di nanoparticelle sono usati come contrassegni per tempestiva, rilevazione robusta e e visiva delle sequenze di DNA specifiche. I prodotti di amplificazione contrassegnati con l'isotiocianato di fluorescina e la biotina possono essere individuati dai biosensori laterali di flusso in 2 minuti.      

Che cosa sono ricottura multipla ed a cicli basati avvolgere di amplificazione (MALBAC)?

Questo metodo è una combinazione ad di intera amplificazione basata a PCR del genoma ed amplificazione multipla di spostamento in cui le mani di fondo casuali che contengono i tag comuni di sequenza sono utilizzate. Le mani di fondo sono ibridate alla sequenza del DNA dell'obiettivo, seguita all'dall'amplificazione basata a reazione di spostamento isotermico del filo della sequenza dell'obiettivo facendo uso della DNA polimerasi di Bst (bacillo stearotermofilus).

Poiché le mani di fondo contengono i tag comuni di sequenza, le copie formate di recente del DNA egualmente contengono le sequenze comuni alle estremità. Ciò piombo alla formazione di amplicons a circuito chiuso ed alla prevenzione dell'amplificazione ripetuta. Sebbene questo metodo sia associato significativamente con meno tendenziosità di amplificazione, l'amplificazione delle sequenze del DNA con le strutture secondarie (cicli di forcella) non può essere possibile con questo metodo. Inoltre, la DNA polimerasi utilizzata in questo metodo ha fedeltà bassa, che aumenta il rischio di risultati erroneamente positivi.  

Che cosa sono i vantaggi di MCDA?

Confrontato ai metodi basati a PCR convenzionali di amplificazione del DNA, MCDA viene con molti vantaggi. Per esempio, nessun'informazione specifica sulla sequenza del DNA dell'obiettivo è richiesta per eseguire MCDA.

Le mani di fondo casuali del hexamer utilizzate nel metodo possono mirare ed ampliare a tutta la sequenza possibile del DNA. Poiché la DNA polimerasi phi29 non dissocia facilmente, i prodotti MCDA-generati di amplificazione sono generalmente più grandi di quello generato con ai i metodi basati a PCR.

Inoltre, in base alla capacità della DNA polimerasi phi29 di usare il DNA a doppia elica della circolare come modello, un metodo moltiplicare-innescato di amplificazione del cerchio rotante è stato messo a punto, che è considerato come la tecnica più robusta per ampliare i modelli circolari del DNA con la dimensione varia.

A causa di questi vantaggi, il metodo di MCDA è ampiamente usato per rilevazione virale circolare del genoma, sequenziamento del genoma nonculturable del virus, rilevazione circolare del plasmide, il intero-genoma che ordinano, il singolo polimorfismo del nucleotide che genotyping e la nuova analisi del metagenome.

Recentemente, il plasmide circolare ed il risparmio di temi di amplificazione di DNA genomico di MCDA è stato migliorato notevolmente fondendo il dominio del C-terminale della DNA polimerasi phi29 con i domini obbligatori del DNA.

Sorgenti

Last Updated: Oct 16, 2020

Dr. Sanchari Sinha Dutta

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Dr. Sanchari Sinha Dutta

Dr. Sanchari Sinha Dutta is a science communicator who believes in spreading the power of science in every corner of the world. She has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree and a Master's of Science (M.Sc.) in biology and human physiology. Following her Master's degree, Sanchari went on to study a Ph.D. in human physiology. She has authored more than 10 original research articles, all of which have been published in world renowned international journals.

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