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Amplificação transversal múltipla do deslocamento

A amplificação transversal múltipla do deslocamento (MCDA) é um método da amplificação do ácido nucleico de uso geral para arranjar em seqüência do inteiro-genoma da único-pilha.

amplificação transversal múltipla do deslocamento

Crédito de imagem: https://www.researchgate.net/figure/The-principle-of-multiple-cross-displacement-amplification-The-schematic-showing-the_fig2_279965601

Que é amplificação transversal múltipla do deslocamento?

O método transversal múltiplo da amplificação (MCDA) do deslocamento usa primeiras demão aleatórias e polimerase de ADN para amplificar o molde circular do ADN. O ADN pode ser amplificado sobre a dobra 10.000 dentro de algumas horas. Em contraste com a corrente da polimerase (PCR) reacção-baseada os métodos para a amplificação inteira do genoma, tal como a reacção em cadeia oligonucleotide-aprontada degenerate da polimerase (DOP-PCR), MCDA cobrem o genoma inteiro.

Contudo, devido ao processo rápido da amplificação, MCDA pode introduzir a polarização seqüência-dependente da amplificação, que não é reprodutível durante todo o genoma da pilha à pilha.

MCDA é usado extensamente para amplificar baixas quantidades de moldes do ADN nas ciências forenses. O método pode mesmo amplificar as amostras do ADN que são danificadas ou para conter variações estocásticas, ou amostras misturadas do ADN. Também, o método pode ser usado para detectar agentes patogénicos com especificidade e sensibilidade altas.

Como executar MCDA?

O método é executado usando primeiras demão aleatórias e polimerase de ADN do fago phi29, que tem 3 um ′ inerente do → 5 do ′ corrigir a actividade do exonuclease. Esta polimerase é associada com o processivity alto, a alta fidelidade, e a função excepcional do deslocamento da costa.

Em MCDA isothermal, que é um método múltiplo da amplificação do deslocamento da costa de seqüências do ADN, dois grupos da primeira demão (o grupo direito e saiu do grupo) são usados. As primeiras demão direitas do grupo são complementares a uma costa do ADN do alvo, e as primeiras demão esquerdas do grupo são complementares à costa oposta do ADN. Em cima da hibridação à seqüência do ADN do alvo, o 5' extremidades das primeiras demão permanecem longe do ponto de origem à seqüência do ADN.

Uma característica original deste método é o deslocamento das primeiras demão durante a réplica polimerase-negociada da seqüência do ADN do alvo. O deslocamento das primeiras demão pela polimerase faz as costas recentemente replicated disponíveis para a hibridação às primeiras demão.

Para a amplificação do inteiro-genoma usando MCDA isothermal, um grupo aleatório de primeiras demão é usado para replicate aleatòria uma parcela de ADN genomic. Em conseqüência, muitas cópias de sobreposição do genoma inteiro podem ser produzidas em um curto período.

Para executar MCDA, o molde do ADN é desnaturado em primeiro lugar usando o calor (95°C) ou tratamento químico. Para a amplificação, as primeiras demão aleatórias ligam o ADN desnaturado, seguido pela síntese do ADN usando a polimerase de ADN phi29. Particularmente, um total de 10 primeiras demão (primeiras demão do deslocamento: 2; primeiras demão do núcleo: 2; primeiras demão da amplificação: 6) são usados para reconhecer e amplificar parcelas diferentes da seqüência do ADN do alvo. A condição isothermal (60 - 65°C) exigido para MCDA podem ser mantidos simplesmente usando um banho maria ou um calefator.

A detecção de produtos da amplificação de MCDA é realizada por biosensors laterais nanoparticle-baseados do fluxo. Os biosensors laterais do fluxo são dispositivos portáteis, sobre papel onde os tipos diferentes de nanoparticles são usados como etiquetas para a detecção rápida, robusta, e visual de fragmentos específicos do ADN. Os produtos da amplificação etiquetados com isothiocyanate de fluoresceína e biotina podem ser detectados por biosensors laterais do fluxo dentro de 2 minutos.      

Que são o recozimento múltiplo e os ciclos dar laços-baseados da amplificação (MALBAC)?

Este método é uma combinação de amplificação inteira PCR-baseada do genoma e amplificação múltipla do deslocamento onde as primeiras demão aleatórias que contêm etiquetas comuns da seqüência são usadas. As primeiras demão são cruzadas à seqüência do ADN do alvo, seguida pela amplificação reacção-baseada da costa deslocamento isothermal da seqüência do alvo usando a polimerase de ADN do Bst (bacilo stearothermophilus).

Porque as primeiras demão contêm etiquetas comuns da seqüência, as cópias recentemente formadas do ADN igualmente contêm seqüências comuns nas extremidades. Isto conduz à formação de amplicons do circuito fechado e à prevenção da amplificação repetida. Embora este método seja associado com significativamente menos polarização da amplificação, a amplificação de seqüências do ADN com estruturas secundárias (laços de gancho de cabelo) não pode ser possível com este método. Também, a polimerase de ADN usada neste método tem a baixa fidelidade, que aumenta o risco de resultados do falso positivo.  

Que são as vantagens de MCDA?

Comparado aos métodos PCR-baseados convencionais da amplificação do ADN, MCDA vem com muitas vantagens. Por exemplo, nenhuma informação específica sobre a seqüência do ADN do alvo é exigida para executar MCDA.

As primeiras demão aleatórias do hexamer usadas no método podem visar e amplificar toda a seqüência possível do ADN. Porque a polimerase de ADN phi29 não se separa facilmente, os produtos MCDA-gerados da amplificação são geralmente maiores do que aquele gerado por métodos PCR-baseados.

Além disso, com base na capacidade da polimerase de ADN phi29 para usar o ADN circular dobro-encalhado como um molde, um método multiplicar-aprontado da amplificação do círculo de rolamento foi desenvolvido, que fosse considerado ser a técnica a mais robusta para amplificar moldes circulares do ADN com tamanho variado.

Devido a estas vantagens, o método de MCDA é amplamente utilizado para a detecção viral circular do genoma, o genoma nonculturable do vírus que arranjam em seqüência, a detecção circular do plasmídeo, o inteiro-genoma que arranjam em seqüência, o único polimorfismo do nucleotide que genotyping, e a análise nova do metagenome.

Recentemente, o plasmídeo circular e a eficiência genomic da amplificação do ADN de MCDA foram melhorados extremamente fundindo o domínio do C-terminal da polimerase de ADN phi29 com domínios obrigatórios do ADN.

Fontes

Last Updated: Oct 16, 2020

Dr. Sanchari Sinha Dutta

Written by

Dr. Sanchari Sinha Dutta

Dr. Sanchari Sinha Dutta is a science communicator who believes in spreading the power of science in every corner of the world. She has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree and a Master's of Science (M.Sc.) in biology and human physiology. Following her Master's degree, Sanchari went on to study a Ph.D. in human physiology. She has authored more than 10 original research articles, all of which have been published in world renowned international journals.

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