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Amplificación cruzada múltiple del desplazamiento

La amplificación cruzada múltiple del desplazamiento (MCDA) es un método de la amplificación del ácido nucléico de uso general para la secuencia unicelular del entero-genoma.

amplificación cruzada múltiple del desplazamiento

Haber de imagen: https://www.researchgate.net/figure/The-principle-of-multiple-cross-displacement-amplification-The-schematic-showing-the_fig2_279965601

¿Cuál es amplificación cruzada múltiple del desplazamiento?

El método cruzado múltiple de la amplificación (MCDA) del desplazamiento utiliza las pinturas de fondo al azar y la polimerasa de DNA para amplificar el patrón circular de la DNA. La DNA se puede amplificar sobre el doblez 10.000 dentro de algunas horas. En contraste con la cadena de la polimerasa (PCR) reacción-basada los métodos para la amplificación entera del genoma, tal como reacción en cadena oligonucleótido-preparada degenerada de polimerasa (DOP-PCR), MCDA revisten el genoma entero.

Sin embargo, debido al proceso rápido de la amplificación, MCDA puede introducir la polarización negativa serie-relacionada de la amplificación, que no es reproductiva en el genoma de la célula a la célula.

MCDA se utiliza extensamente para amplificar cantidades inferiores de patrones de la DNA en ciencias forenses. El método puede incluso amplificar las muestras de la DNA se dañan que o contener variaciones estocásticas, o las muestras mezcladas de la DNA. También, el método se puede utilizar para descubrir agentes patógenos con altas especificidad y sensibilidad.

¿Cómo realizar MCDA?

El método se realiza usando las pinturas de fondo al azar y la polimerasa de DNA del phi29 bacteriófago, que tiene 3 un ′ inherente del → 5 del ′ el corregir de actividad del exonuclease. Esta polimerasa se asocia a la alta función del processivity, de alta fidelidad, y excepcional del cabo del desplazamiento.

En MCDA isotérmico, que es un método múltiple de la amplificación del desplazamiento del cabo de series de la DNA, se utilizan dos equipos de la pintura de fondo (el equipo correcto y salió del equipo). Las pinturas de fondo derechas del equipo son complementarias a un cabo de la DNA del objetivo, y las pinturas de fondo izquierdas del equipo son complementarias al cabo opuesto de la DNA. Sobre el hibridación a la serie de la DNA del objetivo, el 5' los extremos de pinturas de fondo sigue siendo distal a la serie de la DNA.

Una característica única de este método es el desplazamiento de pinturas de fondo durante la réplica polimerasa-mediada de la serie de la DNA del objetivo. El desplazamiento de pinturas de fondo por la polimerasa pone los cabos nuevamente replegados a disposición para el hibridación las pinturas de fondo.

Para la amplificación del entero-genoma usando MCDA isotérmico, un equipo al azar de pinturas de fondo se utiliza para replegar aleatoriamente una porción de DNA genomic. Como consecuencia, muchas copias que recubren del genoma entero se pueden producir en un período corto.

Para realizar MCDA, el patrón de la DNA en primer lugar se desnaturaliza usando el calor (95°C) o tratamiento químico. Para la amplificación, las pinturas de fondo al azar atan la DNA desnaturalizada, seguida por síntesis de la DNA usando la polimerasa de DNA phi29. Determinado, un total de 10 pinturas de fondo (pinturas de fondo del desplazamiento: 2; pinturas de fondo de la base: 2; pinturas de fondo de la amplificación: 6) se utiliza para reconocer y para amplificar diversas porciones de la serie de la DNA del objetivo. La condición isotérmica (60 - 65°C) requerido para MCDA se puede mantener por simple usando un baño de agua o un calentador.

La detección de los productos de la amplificación de MCDA es realizada por los biosensores laterales nanoparticle-basados del flujo. Los biosensores laterales del flujo son dispositivos portátiles, sobre papel en donde diversos tipos de nanoparticles se utilizan como escrituras de la etiqueta para la detección rápida, robusta, y visual de los fragmentos específicos de la DNA. Los productos de la amplificación etiqueta con isotiocianato de fluoresceína y biotina se pueden descubrir por los biosensores laterales del flujo en el plazo de 2 minutos.      

¿Cuáles son la esmaltación múltiple y los ciclos colocar-basados de la amplificación (MALBAC)?

Este método es una combinación de la amplificación entera Polimerización en cadena-basada del genoma y amplificación múltiple del desplazamiento en donde las pinturas de fondo al azar que contienen etiquetas comunes de la serie se utilizan. Las pinturas de fondo se cruzan por hibridación a la serie de la DNA del objetivo, seguida por la amplificación reacción-basada desplazamiento isotérmico del cabo de la serie del objetivo usando la polimerasa de DNA del Bst (bacilo stearotermofilus).

Porque las pinturas de fondo contienen etiquetas comunes de la serie, las copias recién formado de la DNA también contienen series comunes en los extremos. Esto lleva a la formación de amplicons a circuito cerrado y a la prevención de la amplificación relanzada. Aunque este método se asocie importante a menos polarización negativa de la amplificación, la amplificación de las series de la DNA con las estructuras secundarias (rizos de horquilla) no puede ser posible con este método. También, la polimerasa de DNA usada en este método tiene fidelidad inferior, que aumenta el riesgo de resultados falso-positivos.  

¿Cuáles son las ventajas de MCDA?

Comparado a los métodos Polimerización en cadena-basados convencionales de la amplificación de la DNA, MCDA viene con muchas ventajas. Por ejemplo, no se requiere ninguna información específica sobre la serie de la DNA del objetivo para realizar MCDA.

Las pinturas de fondo al azar del hexamer usadas en el método pueden apuntar y amplificar cualquier serie posible de la DNA. Porque la polimerasa de DNA phi29 no disocia fácilmente, los productos MCDA-generados de la amplificación son generalmente más grandes que lo generada por métodos Polimerización en cadena-basados.

Por otra parte, sobre la base de la capacidad de la polimerasa de DNA phi29 de utilizar la DNA circular doble-trenzada como patrón, se ha desarrollado un método multiplicar-preparado de la amplificación del círculo de balanceo, que se considera ser la técnica más robusta para amplificar patrones circulares de la DNA con talla variada.

Debido a estas ventajas, el método de MCDA es ampliamente utilizado para la detección viral circular del genoma, el genoma nonculturable del virus que ordena, la detección circular del plásmido, el entero-genoma que ordena, el único polimorfismo del nucleótido genotyping, y el nuevo análisis del metagenome.

Recientemente, el plásmido circular y la eficiencia genomic de la amplificación de la DNA de MCDA ha sido perfeccionado grandemente fundiendo el dominio de la C-terminal de la polimerasa de DNA phi29 con dominios obligatorios de la DNA.

Fuentes

Last Updated: Oct 16, 2020

Dr. Sanchari Sinha Dutta

Written by

Dr. Sanchari Sinha Dutta

Dr. Sanchari Sinha Dutta is a science communicator who believes in spreading the power of science in every corner of the world. She has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree and a Master's of Science (M.Sc.) in biology and human physiology. Following her Master's degree, Sanchari went on to study a Ph.D. in human physiology. She has authored more than 10 original research articles, all of which have been published in world renowned international journals.

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