Métodos de la espectroscopia

Espectroscopia de la luz Ultraviolent y visible

Las técnicas asociadas a estas regiones del espectro electromágnetico son probablemente las más ampliamente utilizadas para el trabajo analítico.

Las subestructuras moleculares que son responsables de obrar recíprocamente con la radiación electromágnetica se llaman los cromóforos. En proteínas, el relevante pulsa hacia adentro la espectroscopia de UV/Vis es ligazones de péptido, ciertas cadenas laterales del aminoácido (sobre todo triptófano y tirosina) y ciertos grupos y coenzimas prostéticos (e.g grupos de la porfirina presentes en haem).

Los análisis colorimétricos requieren una curva de calibración ser trazados (concentración comparado con la absorción) que deba ser lineal mientras la ley de Cerveza-Lamberto se aplique. Usando esto, la absorción de desconocido entonces se mide y su concentración se puede interpolar de la región lineal del gráfico.

El análisis cualitativo se puede utilizar para determinar ciertas clases de composiciones como muestras puras y en mezclas biológicas. Este tipo de espectroscopia es el más de uso general para la cuantificación de muestras biológicas directamente o vía análisis colorimétricos.

En muchos casos, las proteínas se pueden cuantificar directamente usando sus cromóforos, tirosina y triptófano intrínsecos. Los espectros de la proteína son detectados explorando a partir del 500 a 210 nanómetro. Las características en un espectro de la proteína son una banda en 278/280 nanómetro y otra en 190 nanómetro. La región a partir del 500 a 300 nanómetro ofrece la información valiosa sobre la presencia de cualesquiera grupos o coenzima prostéticos.

Espectroscopia de la fluorescencia

La fluorescencia ocurre donde una transición de la energía de un más alto a un estado más inferior es acompañada por la radiación. Hay muchos y usos altamente variados para la fluorescencia a pesar de que relativamente pocas composiciones exhiben esta característica. Los efectos del pH, de la composición solvente y de la polarización de la fluorescencia pueden todos contribuir a los estudios estructurales.

Fluorescencia intrínseca de la proteína

Las proteínas poseen tres fluorophores intrínsecos: tirosina, triptófano y fenilalanina, aunque este último contribuya poco a la emisión de la fluorescencia de la proteína. La fluorescencia intrínseca de la proteína es determinada generalmente por la fluorescencia del triptófano que se puede excitar selectivamente en 295-305 nanómetro. La excitación en 280 nanómetro lleva a la fluorescencia de la tirosina y del triptófano; los espectros resultantes pudieron entonces contener contribuciones de ambos tipos de residuos.

Fluorescencia extrínseca

Si una molécula del interés es no fluorescente, un fluoróforo externo se puede introducir por el acoplamiento químico o el atascamiento no-covalente. 1 sulfonato de la naftalina de anilino-8- (American National Standard) es un cromóforo extrínseco de uso general que emite solamente fluorescencia débil en el ambiente polar, e.g en la solución acuosa.

Sin embargo, de ambientes no polares, e.g cuando está encuadernada a las regiones hidrofóbicas de proteínas, su emisión de la fluorescencia aumenta importante. Estas características hacen el objeto de valor de la American National Standard para fijar el grado de no-polaridad y al atascamiento del monitor de ligands y de grupos prostéticos.

Dispersar la espectroscopia

El dispersar de la luz puede rendir discernimientos valiosos en las propiedades de macromoléculas, incluyendo la masa molecular, las propiedades de la asociación/de la disociación y la dinámica interna. Cuando la luz de incidente golpea una macromolécula, se dispersa en todas las direcciones y la intensidad de la luz dispersa es solamente una parte de la intensidad original.

La mayor parte de la luz dispersa posee la misma longitud de onda que la luz de incidente; se llama este fenómeno la dispersión luminosa elástico. Cuando la luz dispersa tiene una longitud de onda más alta o baja que la luz de incidente, se llama el fenómeno dispersión luminosa inelástica (espectroscopia de Raman). Las propiedades especiales de laseres con alto monochromaticity, el foco estrecho y la intensidad fuerte, los hacen adecuados idealmente para los usos de la dispersión luminosa.

Espectroscopia atómica

En lo que respecta a la teoría general de transiciones electrónicas, las moléculas dan lugar a espectros de banda mientras que los átomos rinden la línea espectros bien definida. En espectroscopia de emisión atómica (AES), cuando los átomos son emocionados, las longitudes de onda emitidas de la longitud de onda determinada (color) se pueden determinar usando un espectrofotómetro.

En un espectro de un elemento, la amortiguación o las longitudes de onda de la emisión se asocia a las transiciones del electrón debido a un cambio de la energía. Las transiciones del electrón en un átomo son limitadas por la disponibilidad de orbitarios vacíos y las reglas que regulan cómo estos orbitarios son juntos el medio llenado que las rayas de la emisión y de absorción son características para un elemento individual.

Para que los átomos emitan o absorban la radiación monocromática, necesitan ser volatilizadas usando alta energía térmica.

La espectroscopia de emisión atómica (AES) y la espectroscopia de la absorción atómica (AAS) se utilizan generalmente para determinar elementos específicos y sus concentraciones dentro de una muestra. La energía absorbente o emitida es proporcional al número de átomos en el camino óptico. La determinación de la concentración con AES o el AAS se realiza en comparación con patrones de la calibración.

Referencias:

  1. http://www98.griffith.edu.au/dspace/bitstream/handle/10072/34561/62679_1.pdf?sequence=1
  2. http://chemwiki.ucdavis.edu/Analytical_Chemistry/Analytical_Chemistry_2.0/10_Spectroscopic_Methods
  3. https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/Spectrpy/spectro.htm

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Last Updated: Aug 23, 2018

Afsaneh Khetrapal

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Afsaneh Khetrapal

Afsaneh graduated from Warwick University with a First class honours degree in Biomedical science. During her time here her love for neuroscience and scientific journalism only grew and have now steered her into a career with the journal, Scientific Reports under Springer Nature. Of course, she isn’t always immersed in all things science and literary; her free time involves a lot of oil painting and beach-side walks too.

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