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Facendo uso di citometria a flusso per diagnosticare le immunodeficienze primarie (PIDs)

I ricercatori dall'università di Friburgo, Germania hanno messo a punto un metodo cytometry basato di flusso funzionale per la diagnosi delle immunodeficienze primarie innate (PIDs). La tecnica si è applicata ai monociti, il leucocita di modello del sistema immunitario innato.

citometria a flussoCrediti di immagine: Chansom Pantip/Shutterstock.com

La prova è strumentale poichè può fornire l'espressione di citochina di informazioni cioè e l'attivazione funzionali di via di segnalazione come pure indicare tempestivamente la presenza o l'assenza delle celle immuni stesse che informano il processo decisionale clinico.

La citometria a flusso funzionale del monocito offre un'alternativa a diagnosticare le immunodeficienze primarie innate facendo uso delle analisi che determinano la concentrazione di citochine su ELISAs o sul titolo virale; questi non offrono i mezzi di gestire per il numero delle celle rispondenti in ogni campione. Ciò è particolarmente utile per i pazienti che hanno varianti di importanza incerta (VUS).

VUS sono moduli variabili di un gene che sono stati identificati con test genetico, con un effetto indeterminato sulla salubrità dell'organismo. In assenza delle analisi funzionali convalidate per le immunodeficienze innate, la citometria a flusso è uno strumento apprezzato.

Il gruppo ha adattato la citometria a flusso sperimentale standard corrente del monocito allo scopo della convalida della loro applicazione in flussi di lavoro che sono usati per diagnosticare le immunodeficienze primarie innate. Per agire in tal modo, il gruppo ha diagnosticato i campioni pazienti con i pazienti che video un intervallo delle carenze. In primo luogo, per i pazienti con i difetti nelle vie del tipo di tributo di segnalazione NOD2 e del ricevitore.

Il gruppo ha eseguito un'analisi che ha misurato la produzione di TNF. Tipicamente, i pazienti con questa circostanza dimostrano la produzione diminuita di TNF in risposta a stimolo dal lipopolysaccharide (LPS) e da L18-MDP. MDP è un derivato sintetico del dipeptide di muramyl, che è un componente peptidoglycan sia dei batteri gram-positivi che gram-negativi e può suscitare una risposta infiammatoria.

Il gruppo egualmente ha utilizzato questa analisi in pazienti con la malattia di viscere infiammatoria di presto-inizio o con l'inibitore X-collegato sospettato della carenza di apoptosis (XIAP).

Per diagnosticare una carenza in una risposta alterata a IL-10, il gruppo ha adattato l'analisi preincubando il campione con IL-10; ciò impedisce la produzione di TNF indotto tipicamente dai LPS. Per concludere, identificare i pazienti con i difetti nel tipo via di segnalazione dell'interferone di I diserta il gruppo ha usato un'analisi basata citometria a flusso.

Ciò ha compreso l'incubazione delle celle mononucleari di sangue periferico (PMBCs) con l'aumento delle concentrazioni di IFN-a. Dopo questo, le celle sono state risospese in un media che contiene il virus recombinante di stomatite vescicolare (VSV) che sono state costruite per esprimere una proteina fluorescente verde (GFP), generante VSV-GFP.

In risposta a stimolo di IFN-a, la frazione di PMBCs che ha macchiato per GFP è stata catturata come misura di tipo attività dell'interferone di I. Continuo una riduzione stabile del numero delle celle GFP-positive a meno di 20% è stato catturato come conferma dei donatori in buona salute senza le immunodeficienze.

Per diagnosticare i pazienti con una risposta alterata a IL-10, il gruppo ha preincubato le celle con la citochina a concentrazione aumentante. Una riduzione della produzione di TNF è stata misurata. Eseguono lo stesso saggio in pazienti con la malattia di viscere infiammatoria di presto-inizio. I risultati sono stati convalidati facendo uso delle sequenze genetiche per le mutazioni nei geni che gestiscono per i ricevitori IL-10.

Il gruppo egualmente ha eseguito tre analisi cytometric di flusso del monocito che hanno fornito i risultati riproducibili che indicano che i pazienti hanno sofferto da perdita di mutazioni di funzione in mediatori della segnalazione immune sulle superfici delle celle.

Questi risultati sono stati confermati facendo uso dell'analisi di inibizione IL-10, l'analisi di IFN-a che individua la carenza del ricevitore di IFN-a/b e l'analisi di L18-MDP che rivela una carenza nella chinasi complessa e d'interazione 2. dell'installazione della catena di ubiquitin della serina/teonina. Tuttavia, queste prove richiedono la convalida e le prove così funzionali che determinano l'integrità dell'offerta immune di vie di segnalazione parecchi vantaggi.

In primo luogo, possono restituire i risultati fra 24-48 ore, che è pertinente per i professionisti di sanità che devono prendere le decisioni del trattamento. Secondariamente, i risultati ottenuti sono funzionali, a differenza nel caso di VUS di cui gli effetti funzionali richiedono la conferma.

In terzo luogo, le prove funzionali possono interrogare il tutto della via di segnalazione e possono includere le molecole che non sono incluse tipicamente nel repertorio delle proteine catturate per essere indicative di un'immunodeficienza primaria innata. Come tale, non si escludono; tipicamente, l'interi-exome ordinamento ed analisi del gene del candidato mancheranno queste molecole.

Per concludere, il costo dell'analisi funzionale come offerto da citometria a flusso è spesso più basso come il costo del personale e del trattamento dell'informazione. La nota di Elling et al. che lo svantaggio di questi risultati funzionali è il loro ricorso alla conferma genetica (rispetto a funzionale), ma questa fiducia è più facili quando la citometria a flusso funzionale è eseguita come componente di una via di diagnosi.

In conclusione, le analisi che sono presentate dalla robustezza e dall'affidabilità di offerta del gruppo che assicurano che le decisioni cliniche prese potessero essere agite in tal modo hanno basato sui risultati funzionali.

Sorgente

2020) citometrie a flusso funzionali di Amman S. et al. (dei monociti per la diagnosi sistematica delle immunodeficienze primarie innate. Allergia Clin Immunol di J. DOI: 10.1016/j.jaci.2019.09.002.

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Last Updated: Mar 12, 2020

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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