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Usando o Cytometry de fluxo para diagnosticar imunodeficiência preliminares (PIDs)

Os pesquisadores da universidade de Freiburg, Alemanha desenvolveram fluxo funcional um método cytometry-baseado para o diagnóstico de imunodeficiência preliminares inatas (PIDs). A técnica foi aplicada aos monocytes, a leucócito modelo do sistema imunitário inato.

cytometry de fluxoCréditos de imagem: Chansom Pantip/Shutterstock.com

O teste é instrumental porque pode fornecer a expressão do cytokine da informação isto é e a activação funcionais do caminho da sinalização assim como indicar a presença ou a ausência das pilhas imunes ela mesma em tempo oportuno que informam a tomada de decisão clínica.

O cytometry de fluxo funcional do monocyte oferece uma alternativa a diagnosticar imunodeficiência preliminares inatas usando os ensaios que determinam a concentração de cytokines em ELISAs ou no titer viral; estes não oferecem meios do controlo para o número de pilhas responsivas em cada amostra. Isto é especialmente útil para os pacientes que têm variações do significado incerto (VUS).

VUS são os formulários variantes de um gene que foram identificados com o teste genético, com um efeito indeterminado na saúde do organismo. Na ausência dos ensaios funcionais validados para defeitos imunes inatos, o cytometry de fluxo é uma ferramenta valiosa.

A equipe adaptou o cytometry de fluxo experimental padrão actual do monocyte para fins de validar sua aplicação nos trabalhos que são usados para diagnosticar imunodeficiência preliminares inatas. Para fazer assim, a equipe diagnosticou amostras pacientes com os pacientes que indicam uma escala das deficiências. Em primeiro lugar, para pacientes com defeitos no pedágio-como o receptor e os caminhos da sinalização NOD2.

A equipe executou um ensaio que medisse a produção de TNF. Tipicamente, os pacientes com esta circunstância demonstram a produção reduzida de TNF em resposta à estimulação pelo lipopolysaccharide (LPS) e pelo L18-MDP. MDP é um derivado sintético do dipeptide do muramyl, que é um componente peptidoglycan das bactérias Relvado-positivas e Relvado-negativas e pode induzir uma resposta inflamatório.

A equipe igualmente usou este ensaio nos pacientes com doença de entranhas inflamatório do cedo-início ou com o inibidor X-ligado suspeitado da deficiência do apoptosis (XIAP).

Para diagnosticar uma deficiência em uma resposta danificada a IL-10, a equipe adaptou o ensaio preincubating a amostra com IL-10; isto impede a produção de TNF induzido tipicamente por LPS. Finalmente, para identificar pacientes com defeitos no tipo que eu o caminho da sinalização da interferona defects a equipe usei um ensaio baseado fluxo-cytometry.

Isto envolveu a incubação de pilhas mononuclear do sangue periférico (PMBCs) com o aumento de concentrações de IFN-a. Após isto, as pilhas resuspended em um media que contem o vírus de recombinação do stomatitis vesicular (VSV) que foram projectadas para expressar uma proteína fluorescente verde (GFP), gerando VSV-GFP.

Em resposta à estimulação de IFN-a, a fracção de PMBCs que manchou para GFP foi tomada como uma medida do tipo mim actividade da interferona. Sustentado uma redução estável no número de pilhas GFP-positivas a menos de 20% foi tomado como a confirmação de doadores saudáveis sem imunodeficiência.

Para diagnosticar pacientes com uma resposta danificada a IL-10, a equipe pre-incubou pilhas com o cytokine na concentração crescente. Uma redução na produção de TNF foi medida. Executam o mesmo ensaio nos pacientes com a doença de entranhas inflamatório do cedo-início. Os resultados foram validados usando seqüências genéticas para mutações nos genes que controlam para os receptors IL-10.

A equipe igualmente executou três ensaios cytometric do fluxo do monocyte que produziram os resultados reprodutíveis que indicam que os pacientes sofreram da perda de mutações da função nos mediadores da sinalização imune nas superfícies das pilhas.

Estes resultados foram corroborados usando o ensaio da inibição IL-10, o ensaio de IFN-a que detecta a deficiência do receptor de IFN-a/b e o ensaio de L18-MDP que revela uma deficiência na quinase complexa e receptor-interagindo 2. do conjunto da corrente do ubiquitin do serine/treonina. Contudo, estes testes exigem a validação, e os testes tão funcionais que determinam a integridade da oferta imune dos caminhos da sinalização diversas vantagens.

Em primeiro lugar, podem retornar resultados entre 24-48 horas, que é pertinente para os profissionais dos cuidados médicos que devem fazer decisões do tratamento. Em segundo lugar, os resultados obtidos são funcionais, ao contrário no caso de VUS cujos os efeitos funcionais exigem a confirmação.

Em terceiro lugar, os testes funcionais podem perguntar o todo do caminho da sinalização e podem incluir as moléculas que não são incluídas tipicamente no repertório das proteínas tomadas para ser indicativas de uma imunodeficiência preliminar inata. Como tal, não são excluídos; tipicamente, arranjar em seqüência e a análise inteiras-exome do gene do candidato faltarão estas moléculas.

Finalmente, o custo da análise funcional como oferecido pelo cytometry de fluxo é frequentemente mais baixo como o custo dos pessoais e do processo de dados. A nota de Elling e outros que a desvantagem destes resultados funcionais é sua confiança na confirmação genética (ao contrário de funcional), mas esta confiança é mais fáceis quando o cytometry de fluxo funcional é executado como parte de um caminho do diagnóstico.

Em conclusão, os ensaios que são apresentados pelo vigor e pela confiança da oferta do grupo que se asseguram de que as decisões clínicas feitas possam ser feitas basearam assim em resultados funcionais.

Source

Cytometry de fluxo funcionais de Amman S. e outros (2020) dos monocytes para o diagnóstico rotineiro de imunodeficiência preliminares inatas. Alergia Clin Immunol de J. DOI: 10.1016/j.jaci.2019.09.002.

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Last Updated: Mar 12, 2020

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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