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Ad un approccio basato FACS novello a concentrazione di Isoagglutinin in prodotti per uso endovenoso

Un gruppo di ricerca, costituito un fondo per da CSL Behring e piombo da Marc Bürzle, ha pubblicato un documento in cui descrivono un metodo ordinare ordinare (FACS) fluorescenza-attivato delle cellule per quantificazione del isoagglutinin.

Immunoglobuline

Credito di immagine: Utas7777777/Shutterstock.com

Questo metodo di FACS offre i mezzi più precisi di misura delle immunoglobuline per l'applicazione endovenosa e conferma le differenze nei prodotti endovenosi dell'immunoglobulina.

Le molecole di Isoagglutinins trovate nei prodotti endovenosi (IVIG) dell'immunoglobulina sono collegate ad un trattamento chiamato emolisi, la rottura dei globuli rossi. Isoagglutinins è anticorpi che stimolano il ` che attacca insieme' o agglutinazione dei globuli rossi ed è tipicamente gruppo A di anti-sangue ed anticorpi di B.

Come tale, la conoscenza del numero di isoagglutinin è necessaria da gestire i loro livelli e da determinare la loro correlazione con gli eventi emolitici.

La quantificazione precedente di isoagglutinin è stata descritta dalla farmacopea europea (Ph.Eur.) in un'analisi diretta e da allora è stata considerata lo standard per la valutazione dei livelli del isoagglutinin nei prodotti di IVIG. In questa analisi, i campioni di IVIG sono conforme a papaina-hanno trattato globuli rossi1 del gruppo sanguigno di B o di A (RBCs), dopo di che il livello di agglutinazione è visualizzato.

L'agglutinazione è misurata da un cella-reticolo cui è prodotto sopra le diluizioni duplici dei prodotti di IVIG misti con a +/- un punto di titolo. I risultati sono variabili, con le concentrazioni reali fra la metà tanto quanto il risultato dei test ed il doppio importo. Di conseguenza, la correlazione fra il livello del isoagglutinin e l'emolisi è difficili da stabilire.

Lo studio

Il gruppo, intestato da Marc Bürzle, ha messo a punto al il metodo basato FACS che può quantificare il livello del isoagglutinin nel livello di IVIG con più alta precisione che il Ph/Eur corrente. analisi diretta. Questo a approccio basato FACS spiega una metodologia descritta da Gerber ed altri, con l'aggiunta di uno standard di riferimento esterno e di un'analisi biologica.

Ciò comprende la valutazione delle parecchie concentrazioni di serie di standard e di campioni per il confronto di similarità fra loro - la similarità è un presupposto cruciale per l'analisi di analisi biologica. Le analisi biologiche sono comunemente usate nella versione dei prodotti di droga e composti intermedi e formule di caratterizzazione.

Il rapporto del gruppo deriva da un intervallo di IVIG e dei prodotti sottocutanei (SCIG) dell'immunoglobulina come determinato dalla valutazione dei livelli del isoagglutinin. Questo metodo egualmente ha riveduto il trattamento del processo di produzione di IVIG. Inizialmente, le donazioni dai donatori con gli alti titoli anti--Un si sono escluse; un punto più efficiente della cromatografia (IAC) di immunoaffinity sostituisce questo.

Lo IAC diminuisce gli anticorpi anti--Un e anti--b con impatto minimo sulle specificità dell'anticorpo nel prodotto finito senza causare la perdita della concentrazione totale di IgG.

Metodo

Per raggiungere questo, i globuli rossi (RBCs), gli eritrociti, positivi per gli antigeni A1 e B e quantità negativa per il ccddee di RH sono stati usati da tre donatori SRK interregionali l'AG, Berna, Svizzera di Blutspende.

I fenotipi del A1 e della B RBCs sono stati verificati facendo uso di una prova per controllare per vedere se c'è l'agglutinazione facendo uso degli anticorpi anti--Un e anti--b rispettivamente. L'analisi di FACS è stata eseguita da un cytometer di controllo di flusso e da ogni campione di IVIG (standard o controllo), un insieme di 3 concentrazioni è stato prodotto come conseguenza di due diluizioni seriali duplici indipendenti.

Ciascuna delle soluzioni di prova è stata incubata per un'ora su una lastra grossa di microtitolo e dopo incubazione, ciascuna delle lastre grosse di microtitolo è stata centrifugata ed ancora una volta conforme ad incubazione. A seguito di questo secondo giro di incubazione Hey PBS il buffer si è aggiunto e l'intensità mediana della fluorescenza di ogni liquido di prova è stata misurata via citometria a flusso.

Risultati

L'inizio dimostrato risultati la quantificazione dei prodotti del isoagglutinin IGIV ha potuto essere risoluto alta precisione. Riguardante il pH. L'analisi diretta di EUR, questo nuovo metodo mostra la meno variabilità - questa è a causa dei punti finali sulla più vecchia analisi misurata su un disgaggio discreto, a risoluzione bassa. Poiché questa analisi è basata su FACS, i risultati sono continui (come pure elettronici ed obiettivi) e possono compensare l'effetto con pH. EUR.

A causa della lettura obiettiva dell'analisi di FACS. i risultati sono automatizzati elettronicamente ed elaborati, aggiranti l'interpretazione obiettiva stata necessaria nel pH. EUR. analisi. Il nuovo saggio del gruppo poteva egualmente differenziarsi fra i livelli differenti del isoagglutinin nei prodotti disponibili nel commercio di IVIG provati come pure in prodotti prima e dopo essere conforme alle strategie di riduzione del isoagglutinin.

L'analisi era abbastanza sensibile potere individuare la variabilità presente nello stesso batch. Per di più, l'analisi di Bürzle ed altri poteva dimostrare che ci sono potenzialmente clinicamente differenze importanti fra i prodotti di IVIG, tuttavia, dovuto una mancanza un la prova del campione rappresentativo, conclusioni circa le quantità del isoagglutinin non potrebbe essere formata.

Oltre a questo, quando il gruppo ha eseguito la selezione e l'esclusione dei campioni o di usando il punto di riduzione dell'agglutinazione di IAC, i livelli anti- di A nel prodotto di IVIG sono stati diminuiti.

L'uso del punto di riduzione di IAC ha portato giù i livelli a quelli veduti similmente facendo uso di vecchio metodo di frazionamento del tipo di Cohn dell'etanolo, in cui la maggior parte di isoagglutinin è segregata in una frazione.

Attualmente, i livelli di B anti--Un ed anti devono essere uguali a o inferiore al controllo - il risultato della prova dei gruppi IVIG indica che qualcuno concentrazioni in prodotti è superiore a 100% dello standard.

L'accettabilità della versione di questi prodotti è dovuto la variabilità facendo uso di vecchio pH. Analisi diretta di EUR. Il gruppo suggerisce che applicando la nuova analisi, la versione dei batch con i livelli elevati del isoagglutinin sia stata impedita, quindi l'aumento del rigore della specifica.

Bürzle ed i colleghi hanno riconosciuto che il loro metodo è stato limitato in quanto il contenuto del isoagglutinin del materiale standard non è stato conosciuto. Inoltre, non c'è preparato internazionale di riferimento presente per quantificazione anti--Un e anti--b.

Di conseguenza, le concentrazioni del isoagglutinin possono essere espresse soltanto riguardante uno standard. Più ulteriormente, la prova non è 100% specifico per ciascuno degli anticorpi ed il gruppo non può escludere la presenza di anticorpi di non ABO che legano all'altro RBC gli antigeni - questi sono chiamati anticorpi irregolari.

Il gruppo ha escluso il contributo degli anticorpi irregolari basati sul fatto che c'era una forte correlazione fra il pH. Analisi diretta di EUR ed a metodo basato FACS, tuttavia.

Ricerca futura

Mentre la ricerca precedente sulla correlazione fra isoagglutinin livella nei prodotti di IVIG ed il rischio di emolisi sta mancando di, l'approccio basato FACS offre l'opportunità di migliorare questo. Ciò è perché i metodi precedenti non potrebbero misurare con precisione.

Nel totale, questa nuova a analisi basata FACS tiene conto la quantificazione di isoagglutinin sia in prodotti fabbricati facendo uso dei prodotti basati a cromatografia che Cohn-frazionamento basati, oltre al risparmio di temi di riduzione del isoagglutinin come conseguenza di IAC.

L'alta precisione accordata con questo metodo è sperata per provocare le specifiche più rigorose del isoagglutinin per i prodotti come pure potere studiare la correlazione fra emolisi ed il contenuto del isoagglutinin nei prodotti di IVIG.

Finanziamento

Questo lavoro è stato costituito un fondo per da CSL Behring.

Dichiarazione di competere per l'interesse

Tutti gli autori sono corrente, o erano precedentemente, impiegato da CSL Behring, i finanziatori di questa ricerca. Inoltre, Alphonse Hubsch e Dominik Stadler possiedono le azioni di CSL. Non ci sono ulteriori conflitti di interessi da riferire.

Ringraziamenti

Il supporto editoriale è stato fornito HealthComms meridiano srl, costituito un fondo per da CSL Behring.

Sorgente

Bürzle, misura del M. et al. di isoagglutinin in immunoglobuline per l'applicazione endovenosa da citometria a flusso. Biochimica analitica. 2019. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.113534

Further Reading

Last Updated: Jan 31, 2020

Hidaya Aliouche

Written by

Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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