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Uma novela FACS-baseou a aproximação à concentração de Isoagglutinin nos produtos para o uso intravenoso

Um grupo de investigação, financiado por CSL Behring e conduzido por Marc Bürzle, publicou um papel em que descrevem um método classificar-baseado (FACS) pilha fluorescência-ativado para a quantificação do isoagglutinin.

Imunoglobulina

Crédito de imagem: Utas7777777/Shutterstock.com

Este método de FACS oferece uns meios mais precisos de determinar imunoglobulina para a aplicação intravenosa e confirma diferenças em produtos intravenosos da imunoglobulina.

As moléculas de Isoagglutinins encontradas em produtos intravenosos (IVIG) da imunoglobulina são ligadas a um processo chamado a hemólise, o rompimento de glóbulos vermelhos. Isoagglutinins é os anticorpos que estimulam o ` que cola junto' ou a aglutinação de glóbulos vermelhos e é tipicamente o grupo A do anti-sangue e os anticorpos de B.

Como tal, o conhecimento do número de isoagglutinin é necessário para controlar seus níveis e para determinar sua correlação com eventos hemolytic.

A quantificação precedente do isoagglutinin foi esboçada pela farmacopeia européia (Ph.Eur.) em um ensaio directo e desde considerada o padrão para avaliar níveis do isoagglutinin em produtos de IVIG. Neste ensaio, as amostras de IVIG são sujeitas papain-trataram glóbulos1 vermelhos do grupo sanguíneo de A ou de B (RBCs), depois do qual o nível de aglutinação é visualizado.

A aglutinação é medida por um pilha-teste padrão que seja produzido em cima das diluições duplas dos produtos de IVIG misturados com a +/- uma etapa do titer. Os resultados são variáveis, com concentrações reais entre a metade tanto quanto o resultado da análise e à quantidade dobro. Conseqüentemente, a correlação entre o nível do isoagglutinin e a hemólise são difíceis de estabelecer.

O estudo

O grupo, dirigido por Marc Bürzle, desenvolveu o método FACS-baseado que pode determinar o nível do isoagglutinin no nível de IVIG com precisão mais alta do que o Ph/Eur actual. ensaio directo. Isto aproximação FACS-baseada expande em uma metodologia esboçada por Gerber e outros, com a adição de um padrão de referência externo e de um bio-ensaio.

Isto inclui a avaliação de diversas concentrações de uma série de amostras do padrão e do teste para a comparação da similaridade entre elas - a similaridade é uma suposição crucial para a análise do bio-ensaio. Os bio-ensaios são de uso geral na liberação de produtos de droga e intermediários e fórmulas da caracterização.

O relatório do grupo resulta de uma escala de IVIG e de produtos subcutâneos (SCIG) da imunoglobulina como determinada pela avaliação de níveis do isoagglutinin. Este método igualmente revisou o processo do processo de produção de IVIG. Inicialmente, as doações dos doadores com anti-Um titers altos foram excluídas; uma etapa mais eficiente da cromatografia (IAC) do immunoaffinity substitui esta.

O IAC reduz anti-Um e anti-b anticorpos com impacto mínimo em especificidades do anticorpo no produto final sem causar a perda da concentração total de IgG.

Método

Para conseguir este, os glóbulos vermelhos (RBCs), os eritrócites, positivos para os antígenos A1 e B e negativo para o ccddee do RH foram usados de três doadores SRK interregionais AG de Blutspende, Berna, Suíça.

Os fenótipos do A1 e do B RBC foram verificados usando um teste para verificar para ver se há a aglutinação usando anti-Um e anti-b anticorpos respectivamente. O ensaio de FACS foi executado por um cytometer do controle de fluxo, e de cada amostra de IVIG (padrão ou controle), um grupo de 3 concentrações foi produzido em conseqüência de duas diluições de série duplas independentes.

Cada um das soluções do teste foi incubada por uma hora em uma placa de microtiter, e depois da incubação, cada um das placas de microtiter foi centrifugada e mais uma vez assunto à incubação. Depois deste segundo círculo da incubação Hey PBS o amortecedor foi adicionado, e a intensidade mediana da fluorescência de cada solução do teste foi medida através do cytometry de fluxo.

Resultados

O começo demonstrado resultados a quantificação de produtos do isoagglutinin IGIV podia ser determinado elevada precisão. Relativo ao pH. O ensaio directo de EUR, este método novo mostra menos variabilidade - este é devido aos valores-limite no ensaio mais velho medido em uma escala discreta, na baixa definição. Porque este ensaio é baseado em FACS, os resultados são contínuos (assim como eletrônicos e objetivos) e podem compensar o efeito com pH. EUR.

Devido ao readout objetivo do ensaio de FACS. os resultados são automatizados e processados electronicamente, contornando a interpretação objetiva necessário no pH. EUR. ensaio. O ensaio novo da equipe podia igualmente diferenciar-se entre níveis diferentes do isoagglutinin nos produtos disponíveis no comércio de IVIG testados, assim como nos produtos antes e depois de ser sujeito às estratégias da redução do isoagglutinin.

O ensaio era sensível bastante poder detectar a variabilidade actual no mesmo grupo. Mais importante ainda, a análise de Bürzle e outros podia demonstrar que há potencial clìnica umas diferenças importantes entre os produtos de IVIG, contudo, devido a uma falta um o teste da amostra representativa, conclusões sobre quantidades do isoagglutinin não poderia ser formada.

Além do que isto, quando a equipe executou a selecção e a exclusão das amostras ou de usar a etapa da redução da aglutinação do IAC, os anti níveis de A no produto de IVIG foram reduzidos.

O uso da etapa da redução do IAC derrubou os níveis àqueles considerados similarmente usando o método velho Cohn-como do fraccionamento do álcool etílico, em que a maioria do isoagglutinin é segregada em uma fracção.

Presentemente, os níveis de anti-Um e anti B devem ser iguais a ou abaixar do que o controle - o resultado do teste dos grupos IVIG mostra que alguém concentrações nos produtos é mais alto de 100% do padrão.

A aceitabilidade da liberação destes produtos é devido à variabilidade usando o pH velho. Ensaio directo de EUR. O grupo sugere que executando o ensaio novo, a liberação dos grupos com níveis mais altos do isoagglutinin esteja impedida, daqui o aumento da dureza da especificação.

Bürzle e os colegas reconheceram que seu método estêve limitado que o índice do isoagglutinin do material padrão não estêve sabido. Também, não há nenhuma preparação internacional da referência actual para a anti-Um e anti-b quantificação.

Em conseqüência, as concentrações do isoagglutinin podem somente ser expressadas relativo a um padrão. Mais, o teste não é específico de 100% para cada um dos anticorpos, e a equipe não pode excluir a presença de anticorpos do não-ABO que ligam a outros antígenos do RBC - estes são chamados anticorpos irregulares.

A equipe excluiu a contribuição dos anticorpos irregulares baseados no facto de que havia uma correlação forte entre o pH. Ensaio directo de EUR e método FACS-baseado, contudo.

Pesquisa futura

Quando a pesquisa precedente sobre a correlação entre o isoagglutinin nivelar em produtos de IVIG e o risco de hemólise está faltando, a aproximação baseada FACS oferece a oportunidade de melhorar isto. Isto é porque os métodos precedentes não poderiam medir com precisão.

No total, este ensaio FACS-baseado novo permite a quantificação do isoagglutinin ambos em produtos cromatografia-baseados e Cohn-fraccionamento baseados manufacturados da utilização dos produtos, além do que a eficiência da redução do isoagglutinin em conseqüência do IAC.

A elevada precisão tida recursos para através deste método é esperada conduzir a umas especificações mais estritas do isoagglutinin para produtos, assim como poder investigar a correlação entre a hemólise e o índice do isoagglutinin em produtos de IVIG.

Financiamento

Este trabalho foi financiado por CSL Behring.

Declaração da competência para o interesse

Todos os autores são actualmente, ou eram previamente, empregado por CSL Behring, os investidores desta pesquisa. Também, Alphonse Hubsch e Dominik Stadler possuem partes de CSL. Não há nenhum conflito de interesses mais adicional a relatar.

Reconhecimentos

O apoio editorial foi fornecido HealthComms meridiano Ltd, financiado por CSL Behring.

Source

Bürzle, medida do M. e outros do isoagglutinin nas imunoglobulina para a aplicação intravenosa pelo cytometry de fluxo. Bioquímica analítica. 2019. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.113534

Further Reading

Last Updated: Jan 31, 2020

Hidaya Aliouche

Written by

Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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