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Una novela FACS-basó la aproximación a la concentración de Isoagglutinin en los productos para el uso intravenoso

Un grupo de investigación, financiado por CSL Behring y llevado por Marc Bürzle, ha publicado un papel en el cual describen un método clasificación-basado (FACS) célula fluorescencia-activado para la cuantificación del isoagglutinin.

Inmunoglobulinas

Haber de imagen: Utas7777777/Shutterstock.com

Este método de FACS ofrece medios más exactos de cuantificar las inmunoglobulinas para el uso intravenoso y confirma diferencias en productos intravenosos de la inmunoglobulina.

Las moléculas de Isoagglutinins encontradas en productos intravenosos (IVIG) de la inmunoglobulina se conectan a un proceso llamado la hemólisis, la ruptura de glóbulos rojos. Isoagglutinins es los anticuerpos que estimulan el ` que adhiere juntos' o aglutinación de glóbulos rojos y es típicamente el grupo A de la anti-sangre y anticuerpos de B.

Como tal, el conocimiento del número de isoagglutinin es necesario controlar sus niveles y determinar su correlación con acciones hemolíticas.

La cuantificación anterior del isoagglutinin ha sido contorneada por la farmacopea europea (Ph.Eur.) en un análisis directo y desde entonces considerada el patrón para fijar niveles del isoagglutinin en productos de IVIG. En este análisis, las muestras de IVIG están conforme a papaína-trataron los glóbulos1 rojos del grupo sanguíneo de A o de B (RBCs), después de lo cual el nivel de aglutinación se visualiza.

La aglutinación es medida por una célula-configuración con la cual se produzca sobre diluciones dobles de los productos de IVIG mezclados a +/- un paso del título. Los resultados son variables, con concentraciones reales entre la mitad tanto como el resultado de la prueba y la cantidad doble. Por lo tanto, la correlación entre el nivel del isoagglutinin y la hemólisis es difíciles de establecer.

El estudio

El grupo, dirigido por Marc Bürzle, ha desarrollado el método FACS-basado que puede cuantificar el nivel del isoagglutinin en el nivel de IVIG con una precisión más alta que el Ph/Eur actual. análisis directo. Esto aproximación FACS-basada se despliega en una metodología contorneada por Gerber y otros, con la adición de un patrón de referencia externa y de una prueba biológica.

Esto incluye la evaluación de varias concentraciones de una serie de muestras del patrón y de la prueba para la comparación de la semejanza entre ellas - la semejanza es una suposición crucial para el análisis de la prueba biológica. Las pruebas biológicas son de uso general en la baja de los productos de droga y los intermedios y las fórmulas el caracterizar.

El parte del grupo resulta de un alcance de IVIG y de los productos subcutáneos (SCIG) de la inmunoglobulina según lo determinado por la evaluación de los niveles del isoagglutinin. Este método también ha reacondicionado el proceso del proceso de producción de IVIG. Inicialmente, las donaciones de donantes con altos títulos antis-UNo fueron excluidas; un paso más eficiente de la cromatografía (IAC) del immunoaffinity reemplaza esto.

El IAC reduce los anticuerpos antis-UNo y antis-b con impacto mínimo en especificidades del anticuerpo en el producto final sin causar la baja de la concentración total de IgG.

Método

Para lograr esto, utilizaron a los glóbulos (RBCs) rojos, los eritrocitos, positivos para los antígenos A1 y B y negativa para el ccddee el derecho a partir de tres donantes SRK interregionales AG, Berna, Suiza de Blutspende.

Los fenotipos del A1 y del B RBCs fueron verificados usando una prueba para verificar para saber si hay aglutinación usando los anticuerpos antis-UNo y antis-b respectivamente. El análisis de FACS fue realizado por un cytometer del mando de flujo, y de cada muestra de IVIG (patrón o mando), un equipo de 3 concentraciones fue producido como resultado de dos dobles diluciones seriales independientes.

Cada uno de las soluciones de la prueba fue incubada por una hora en una placa de microtítulo, y después de la incubación, cada uno de las placas de microtítulo fue centrifugada y de nuevo conforme a la incubación. Después de este segundo cartucho de la incubación ey PBS el almacenador intermedio fue agregado, y la intensidad mediana de la fluorescencia de cada solución de la prueba fue medida vía cytometry de flujo.

Resultados

El comienzo demostrado los resultados la cuantificación de los productos del isoagglutinin IGIV podía ser resuelto alta precisión. En relación con el pH. El análisis directo del EUR, este nuevo método muestra menos variabilidad - éste está debido a las puntos finales en el más viejo análisis medido en una escala discreta, en la resolución inferior. Porque este análisis se basa en FACS, los resultados son contínuos (así como electrónicos y objetivos) y pueden compensar el efecto con el pH. EUR.

Debido a la lectura objetivo del análisis de FACS. los resultados se automatizan y se tramitan electrónicamente, evitando la interpretación objetivo necesaria en el pH. EUR. análisis. El nuevo ensayo de las personas podía también distinguir entre diversos niveles del isoagglutinin en los productos disponibles en el comercio de IVIG probados, así como en productos antes y después de ser conforme a estrategias de la reducción del isoagglutinin.

El análisis era bastante sensible poder descubrir la variabilidad presente en la misma mezcla. Más importante, el análisis de Bürzle y otros podía demostrar que hay potencialmente clínico diferencias importantes entre los productos de IVIG, sin embargo, debido a una falta a la prueba de la muestra representativa, las conclusiones sobre cantidades del isoagglutinin no podría ser formado.

Además de esto, cuando las personas realizaron la investigación y la exclusión de muestras o de usar el paso de la reducción de la aglutinación del IAC, los niveles antis de A en el producto de IVIG fueron reducidos.

El uso del paso de la reducción del IAC derribó los niveles a ésos considerados semejantemente usando el viejo método Cohn-como de fraccionamiento del etanol, en el cual segregan a la mayoría de isoagglutinin en una fracción.

Actualmente, los niveles de B anti-UNo y anti deben ser iguales a o bajar que el mando - el resultado de la prueba de los grupos IVIG muestra que alguien las concentraciones en productos es más alto de 100% del patrón.

La aceptación de la baja de estos productos es debido a la variabilidad usando el viejo pH. Análisis directo del EUR. El grupo sugiere que ejecutando el nuevo análisis, la baja de mezclas con niveles más altos del isoagglutinin fuera prevenida, por lo tanto el aumento del rigor del pliego de condiciones.

Bürzle y los colegas reconocieron que su método fue limitado en que el contenido del isoagglutinin del material estándar no era sabido. También, no hay preparación internacional de la referencia presente para la cuantificación anti-UNo y anti-b.

Como consecuencia, las concentraciones del isoagglutinin se pueden expresar solamente en relación con un patrón. Además, la prueba no es específico del 100% para cada uno de los anticuerpos, y las personas no pueden excluir la presencia de anticuerpos del no-ABO que atan al otro RBC los antígenos - éstos se llaman los anticuerpos irregulares.

Las personas excluyeron la contribución de los anticuerpos irregulares basados en el hecho de que había una correlación fuerte entre el pH. Análisis directo del EUR y método FACS-basado, sin embargo.

Investigación futura

Mientras que la investigación anterior sobre la correlación entre el isoagglutinin nivela en productos de IVIG y el riesgo de hemólisis está faltando, la aproximación basada FACS ofrece la oportunidad de perfeccionar esto. Esto es porque los métodos anteriores no podrían medir con la precisión.

En total, este nuevo análisis FACS-basado permite la cuantificación del isoagglutinin en los productos manufacturados usando productos cromatografía-basados y Cohn-fraccionamiento basados, además de la eficiencia de la reducción del isoagglutinin como resultado del IAC.

La alta precisión permitida con este método se espera para dar lugar a pliegos de condiciones más rigurosos del isoagglutinin para los productos, así como para poder investigar la correlación entre la hemólisis y el contenido del isoagglutinin en productos de IVIG.

Financiamiento

Este trabajo fue financiado por CSL Behring.

Declaración de la competición para el interés

Todos los autores están actualmente, o estaban previamente, empleado por CSL Behring, los proveedores de fondos de esta investigación. También, Alfonso Hubsch y Domingo Stadler poseen las partes de CSL. No hay otros conflictos de intereses a denunciar.

Acuses de recibo

El apoyo editorial fue proporcionado por Meridian HealthComms Ltd, financiado por CSL Behring.

Fuente

Bürzle, medición del M. y otros del isoagglutinin en las inmunoglobulinas para el uso intravenoso por cytometry de flujo. Bioquímica analítica. 2019. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.113534

Further Reading

Last Updated: Jan 31, 2020

Hidaya Aliouche

Written by

Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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