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Uma vista geral de ensaios do RNA

A coleção de moléculas do RNA em uma pilha, conhecida como o transcriptome, guardara a chave a uma riqueza da informação útil. Pode dizer-nos onde os genes são desligados sobre e, assim como descobrindo a que extensão o gene é activo.

Arranjar em seqüência do RNA é um método que permita que os cientistas olhem no transcriptome de uma pilha e adquiram esta informação.

Os ensaios que realizam arranjar em seqüência do RNA têm vantagens sobre métodos precedentes de investigar a expressão genética tal como Sanger que arranja em seqüência e métodos microarray-baseados porque fornecem uma cobertura mais de alta resolução e maior do transcriptome.

Além do que o ganho da introspecção na expressão genética dentro das pilhas dos tecidos e dos órgãos, estes ensaios podem identificar transcritos novos e genes alternativamente emendados do achado, assim como descobrir a expressão alelo-específica.

RNA

Crédito de imagem: Petarg/Shutterstock.com

Os ensaios do RNA tiraram proveito dos avanços recentes em seus processos, fazendo os capazes de determinar a complexidade funcional da transcrição. Os ensaios modernos podem ser usados para explorar o RNA total, e os subtipos diferentes do RNA tais como o pre-mRNA, o microRNA, o RNA de interferência pequeno, e o ncRNA longo.

O significado de ensaios do RNA é que fornecem um transcrito global que perfila a ferramenta que é provável ser essencial para desenvolver nossa compreensão de como os genes influenciam a doença e o mais, assim como desenvolver ferramentas diagnósticas novas e mesmo tratamentos.

Tipos de ensaio do RNA

As classificações principais do ensaio do RNA são preparação da biblioteca, RNA pequeno de RNA/non-coding que arranjam em seqüência, arranjar em seqüência directo do RNA, e síntese do cDNA. Quando estes não forem os únicos métodos, são aqueles que são bem conhecidos e se têm provado já úteis dentro das disciplinas biológicas numerosas.

A técnica da biblioteca abrange três etapas gerais: Isolamento do RNA, selecção do RNA/prostração, e síntese do cDNA. O isolamento do RNA envolve separar o RNA do tecido e misturá-lo com o deoxyribonuclease.

Um gel é usado então para medir a degradação do RNA, e a electroforese capilar calcula um número da integridade do RNA à amostra. Durante a selecção/prostração do RNA o RNA isolado pode ser filtrado para seleccionar isso que liga às seqüências específicas. Finalmente, o RNA é reverso transcrito no cDNA para permitir a amplificação. Esta fase permite que a seqüência seja analisada.

A técnica conhecida como arranjar em seqüência pequeno do RNA de RNA/non-coding é uma alteração do método da biblioteca. Envolve o RNA que está sendo seleccionado com base em uma escala visada do tamanho. Um gel da tamanho-exclusão, uns grânulos magnéticos ou um jogo comercialmente desenvolvido são usados para isolar o tamanho desejado do RNA. Este ADN isolado é refinado então, e o reverso é transcrito no cDNA.

Arranjar em seqüência directo do RNA foi estabelecido para superar as falhas dos métodos precedentes que confiam em converter o RNA no cDNA, na amplificação, na ligadura e nas outras manipulações que introduzem o erro. o RNA directo da Único-molécula que arranja em seqüência usos uma maneira maciça paralela às moléculas do RNA da seqüência directamente, e remove este risco de introduzir polarizações.

Finalmente, os métodos do RNA da único-pilha que arranjam em seqüência (scRNA-Segs.s) foram desenvolvidos para analisar a expressão de RNAs das grandes populações das pilhas. Os métodos como microarrays e RNA-Segs. maioria padrão são ensaios abrangidos nesta classificação. Podem ser usados para gerar perfis da expressão de pilhas individuais, embora não forneçam um olhar detalhado em cada único RNA expressado dentro de uma pilha de amostra. Um pouco, os testes padrões da expressão genética são determinados pela análise de aglomeração do gene, que provou ser crucial em identificar tipos raros da pilha.

Uns métodos mais novos incluem transcriptase-PCR quantitativo do reverso (qRT-PCR), um método que confie outra vez na transcrição do RNA ao cDNA, que é usado então como um molde para a reacção do qPCR. Este método tem sido usado já em diversas aplicações tais como a validação de RNAi, a análise da expressão genética, a validação do microarray, o teste genético, a detecção do micróbio patogénico, e a pesquisa da doença.

Outros métodos recentemente em desenvolvimento incluem o RNA da próxima geração que arranja em seqüência, e multiplexam a tecnologia cor-codificada digital do código de barras, que tem sido usada recentemente nos estudos daquelas com câncer pulmonar não-pequeno da pilha.

Uso clínico de ensaios do RNA

Os ensaios do RNA tornaram-se bem conhecidos em várias aplicações clínicas. Provaram seu uso em desenvolver nosso conhecimento de, e na ajuda no diagnóstico, no prognóstico, e na avaliação da conformidade terapêutica em diversas doenças, tais como tipos diferentes de cancro, de uma variedade de doenças infecciosas, e de infecções tais como HPV.

As técnicas igualmente conduziram a introspecção considerável na revelação dos embriões e dos organismos.

Possivelmente a função a mais valiosa de ensaios do RNA consiste em identificar fusões do gene e a expressão diferencial dos transcritos que são reconhecidos já como sendo fundamentais na iniciação da doença. Há uma grande oportunidade de usar ensaios do RNA neste campo.

Também, os ensaios do RNA estão sendo usados na pesquisa que impactará eventualmente a paisagem clínica. Por exemplo, RNAs extracelular está sendo explorado como indicadores diagnósticos não invasores potenciais da doença. Enquanto a pesquisa continua nós podemos ver a revelação de padrões da marca de nível e de optimização do ensaio nesta área, abrindo a até o uso clínico com esta finalidade.

O futuro podia considerar estes ensaios ajudar a desenvolver moléculas do RNA como agentes terapêuticos. As revelações futuras são igualmente prováveis considerar a melhoria de ensaios do RNA, abrindo os até o uso em mais aplicações, primeiramente no campos da doença auto-imune, da revelação, da doença infecciosa, da oncologia, e da neurologia.

Fontes:

  • Cattani, P., Siddu, A., D'Onghia, S., Marchetti, S., Santangelo, R., Vellone, V., Zannoni, G. e Fadda, G. (2009). Ensaios do RNA (E6 e E7) contra ensaios do ADN (E6 e E7) para a avaliação de risco para as mulheres contaminadas com Papillomavirus humano. Jornal da microbiologia clínica, 47(7), pp.2136-2141. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2708475/
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Last Updated: Feb 20, 2020

Sarah Moore

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