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Aplicações da CLARIDADE

A CLARIDADE ou o Tecido-hYdrogel situ-hibridação-compatível rígido Lipido-trocado espaço livre da imagem lactente de Acrylamidehybridized/Immunostaining/In são um método da fixação e do esclarecimento histológicos.

A CLARIDADE está usada para executar o immunohistochemistry enquanto mantiver fluorophores quando imagem lactente e execução da reconstrução 3D para grandes volumes. Este método é baseado em criar um hydrogel que remova os lipidos e mantenha as proteínas e o ADN do tecido intactos.

A CLARIDADE é um método popular de remover os lipidos do tecido de cérebro a fim considerar outras estruturas tais como os neurôniosMichael Braham | Shutterstock

Mecanismo da CLARIDADE

A CLARIDADE envolve criar um híbrido do tecido-hydrogel polimerizando proteínas junto com o ADN e o RNA usando o acrilamido. Isto é baseado na capacidade do acrilamido para ligar as moléculas que têm as extremidades da amina, incluindo as proteínas, ADN, e o RNA. Isto cria uma estrutura esqueletal que as proteínas maiores possam ainda permear.

O detergente é adicionado então para encapsular lipidos nos micelles que são levados então através dos poros da estrutura esqueletal usando um campo elétrico aplicado. Os anticorpos a ser usados em um immunoassay são adicionados subseqüentemente e podem igualmente passar através dos poros e ligar às proteínas da membrana.

A criação do procedimento passo a passo para maior clareza é: fixando o tecido, formando hydrogels, extraindo os lipidos, e a harmonização do R.I.

Amostras do ser humano da imagem lactente

Uma aplicação poderoso da CLARIDADE encontra-se em sua capacidade para permitir a imagem lactente clara do cérebro humano durante a patogénese ou estado doente. Os casos que foram visualizados usando a CLARIDADE incluem Alzheimer, Parkinson, neurodegeneration durante a doença mitocondrial, o autismo, e a epilepsia intratável. Estes foram visualizados nos tecidos que eram fixos usando a formalina.

As amostras do cérebro que foram fixadas no paraformaldehyde e sujeitadas ao cryopreservation na sacarina foram examinadas igualmente usando a CLARIDADE. Nesses casos, o myelination e a duração da fixação na formalina determinam frequentemente a velocidade com que o afastamento do tecido é obtido. Contudo, em alguns casos, o tecido foi observado para expandir transiente quando os tecidos foram expor aos métodos do esclarecimento do tecido para durações prolongadas, tais como maior de 40 dias.

Imagem lactente o sistema nervoso e o Vasculature

Os estudos mostram que o músculo esqueletal pode ser cancelado usando a técnica da CLARIDADE; contudo, é mais difícil cancelar junções neuromusculares. Isto é porque o cruz-ligamento e a fixação extensivos nestas junções impedem frequentemente o acesso de pontas de prova etiquetadas aos receptors do acetylcholine.

, Contudo, foi possível visar os nervos periféricos usando o immunohistochemistry ou projétis luminosos lipofílicos. As pilhas Endothelial podem igualmente ser imaged pelo tratamento com uma Dil-tintura ou pelo biocytin antes de fixar.

Músculo e osso da imagem lactente

Os tendões são ricos no colagénio que faz os opacos e difíceis cancelar. Isto pode ser melhorado aumentando o tempo do esclarecimento durante a CLARIDADE e igualmente ajustando o R.I. Chondrocytes ou as pilhas que fazem a cartilagem podem ser manchados usando a tintura lipofílica, tal como o Dil-SP.

O tecido do osso tem o baixo índice do lipido, o índice mineral adicional, e a medula. Estes tecidos podem ser cancelados usando métodos solvente-baseados ou adicionando uma etapa da descalcificação. Nesta etapa, o tecido é mantido intermitentemente no EDTA e no SDS no pH aumentado.

Esta alteração gera uma profundidade do visualização de 200-300µm. A etapa da remoção do cálcio pode fornecer uma profundidade adicional do visualização de 1,5 milímetros. A medula é igualmente rica na proteína do heme que gera o autofluorescence. Isto é ajustado removendo a parte do heme usando o amino álcool antes do processo de harmonização refractive.

Imagem lactente os outros órgãos e espécie

A CLARIDADE foi usada à imagem diversos órgãos, tais como o fígado, o rim, o pâncreas, as glândulas ad-renais, o baço, o tecido lymphoid, o intestino, os testículos, os ovário, o tecido de pulmão, etc. Contudo, o protocolo deve ser alterado baseou no tipo do tecido porque os tecidos diferentes têm densidades diferentes, relações das proteínas e dos lipidos, épocas de cancelamento, e o R.I. médio do hydrogel.

Este método foi executado igualmente em outros organismos, tais como coelhos, galinhas, zebrafish, Xenopus, polvo, e outro. No caso das plantas, uma etapa adicional da degradação é adicionada para remover o esclarecimento do tecido do cargo da parede de pilha. Isto é feito para cancelar e manchar as pilhas sem recorrer à secção do tecido.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Apr 5, 2019

Dr. Surat P

Written by

Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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