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Usos de la CLARIDAD

La CLARIDAD o el Tejido-hidrogel situ-hibridación-compatible rígido Lípido-intercambiado claro de la proyección de imagen/Immunostaining/In de Acrylamidehybridized es un método de fijación y de claro histológicos.

La CLARIDAD se utiliza para realizar el immunohistochemistry mientras que mantiene fluorophores mientras que proyección de imagen y ejecución de la reconstrucción 3D para los volúmenes grandes. Este método se basa en crear un hidrogel que quite los lípidos y mantenga las proteínas y la DNA del tejido intactas.

La CLARIDAD es un método popular de quitar los lípidos del tejido cerebral para considerar otras estructuras tales como neuronasMichael Braham | Shutterstock

Mecanismo de la CLARIDAD

La CLARIDAD implica el crear de un híbrido del tejido-hidrogel polimerizando las proteínas junto con la DNA y el ARN usando la acrilamida. Esto se basa en la capacidad de la acrilamida de atar las moléculas que tienen extremos de la amina, incluyendo las proteínas, DNA, y el ARN. Esto crea una estructura esquelética que proteínas más grandes puedan todavía impregnar.

El detersorio entonces se agrega para encapsular los lípidos en las micelas que entonces se llevan a través de los poros de la estructura esquelética usando un campo eléctrico aplicado. Los anticuerpos que se utilizarán en un immunoensayo se agregan posteriormente y pueden también pasar a través de los poros y atar a las proteínas de la membrana.

La creación del procedimiento gradual para mayor clareza está: reparando el tejido, formando hidrogeles, extrayendo los lípidos, y la igualación del índice de refracción.

Muestras del ser humano de la proyección de imagen

Un uso potente de la CLARIDAD miente en su capacidad de permitir la proyección de imagen sin obstrucción del cerebro humano durante la patogenesia o el estado enfermo. Los casos que se han visualizado usando CLARIDAD incluyen a Alzheimer, Parkinson, neurodegeneration durante enfermedad mitocondrial, autismo, y epilepsia insuperable. Éstos fueron visualizados en los tejidos que eran fijos usando el formalina.

Las muestras del cerebro que se han reparado en paraformaldehido y se han sujetado al cryopreservation en sucrosa también se han examinado usando CLARIDAD. En estos casos, el myelination y la duración de la fijación en formalina determina a menudo la velocidad con la cual se obtiene la tolerancia del tejido. Sin embargo, en algunos casos, el tejido se ha observado para desplegarse transitorio cuando los tejidos fueron expuestos a los métodos del claro del tejido para las duraciones extendidas, tales como mayor de 40 días.

Proyección de imagen el sistema nervioso y la vasculatura

Los estudios muestran que el músculo esquelético se puede autorizar usando la técnica de la CLARIDAD; sin embargo, es más difícil autorizar uniones neuromusculares. Esto es porque la interconexión y la fijación extensas en estas uniones previenen a menudo el acceso de antenas etiqueta a los receptores de la acetilcolina.

, Sin embargo, ha sido posible apuntar los nervios periféricos usando el immunohistochemistry o trazadores lipofílicos. Las células endoteliales pueden también ser reflejadas por el tratamiento con un Dil-tinte o el biocytin antes de reparar.

Músculo y hueso de la proyección de imagen

Los tendones son ricos en el colágeno que los hace opacos y difíciles autorizar. Esto puede ser perfeccionada aumentando el tiempo del claro durante CLARIDAD y también ajustando el índice de refracción. Chondrocytes o las células que hacen el cartílago se puede manchar usando el tinte lipofílico, tal como Dil-SP.

El tejido del hueso tiene el contenido inferior del lípido, el contenido mineral adicional, y médula. Estos tejidos se pueden autorizar usando métodos disolvente-basados o agregando un paso de la descalcificación. En este paso, el tejido se mantiene intermitente EDTA y el SDS en el pH creciente.

Esta modificación genera una profundidad de la visualización de los 200-300µm. El paso del retiro del calcio puede ofrecer una profundidad adicional de la visualización de 1,5 milímetros. La médula es también rica en la proteína del heme que genera autofluorescence. Esto es ajustada quitando la mitad del heme usando el alcohol amino antes del proceso de la igualación refractiva.

Proyección de imagen los otros órganos y especie

La CLARIDAD se ha utilizado a la imagen varios órganos, tales como el hígado, el riñón, el páncreas, las casquillos del prensaestopas suprarrenales, el bazo, el tejido linfoide, el intestino, los testículos, los ovarios, el tejido pulmonar, el etc. Sin embargo, el protocolo se debe modificar basó en el tipo del tejido pues diversos tejidos tienen diversas densidades, índices de proteínas y de lípidos, épocas que autorizan, y el índice de refracción medio del hidrogel.

Este método también se ha realizado en otros organismos, tales como conejos, pollos, zebrafish, Xenopus, pulpo, y otros. En el caso de las instalaciones, un paso adicional de la degradación se agrega para quitar el claro del tejido del poste de la pared celular. Esto se hace para autorizar y para manchar las células sin el recurso al seccionamiento del tejido.

Fuentes

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Last Updated: Apr 5, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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