Automatisation et préparation des échantillons pour l'ordonnancement de Sanger

L'ordonnancement de Sanger est un ADN ordonnançant la méthode développée par Fred Sanger en 1977. La technique est basée sur la constitution des dideoxynucleotides réseau-mettants fin par l'ADN polymérase pendant la réplication de l'ADN. Ceci produit les portées d'ADN correspondant à chaque nucléotide. Ces séquences peuvent alors être séparées utilisant l'électrophorèse en gel de polyacrylamide.

L'ordonnancement de Sanger exige d'une matrice monocatenaire d'ADN, amorces d'ADN pour commencer la réplication, ADN polymérase, deoxynucleotriphosphates pour établir le réseau, et réseau-mettre fin à des dideoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs). Quatre réactions de ordonnancement sont correspondance commencée à chacun des nucléotides actuels dans l'ADN : adénosine, guanine, cytosine, et thymines.

Un des quatre dideoxynucleotides réseau-mettants fin est ajouté à chaque récipient de réaction avec les autres matériaux exigés. La réplication de l'ADN est commencée, puis le récipient de réaction est passionné, séparant les réseaux, et refroidi de nouveau ainsi la réaction relance avec les amorces fraîches. La réaction est thermiquement faite un cycle environ trente-cinq fois, et alors les réseaux donnants droit sont séparés côte à côte sur un gel de polyacrylamide. Le résultat peut « être affiché de gauche à droite », de haut en bas.

Préparation des échantillons

La qualité de matrice d'ADN est un facteur critique dans l'ordonnancement couronné de succès de Sanger. L'ADN pour ordonnancer est copié dans un plasmide--une pièce circulaire d'ADN qui peut alors être employée pour amplifier la matrice. L'échantillon doit être soigneusement préparé pour éviter la contamination par ADN génomique, ARN, ou d'autres sources de non-matrice ADN.

Une fois copié dans un plasmide, la matrice est amplifiée par ACP, dosée, et diluée à la concentration désirée pour l'ordonnancement.

Automatisation

Le Sanger ordonnançant le procédé peut être laborieux pour effectuer à la main. De nos jours, l'ordonnancement de Sanger est habituellement automatisé. Les instruments de ordonnancement robotisés combinent l'ordonnancement avec les amorces fluorescent marquées ou les terminateurs à chaînes de dideoxy avec l'électrophorèse en gel et les données de l'ordinateur de polyacrylamide captent.

Crédit : mllejules/Shutterstock.com

Une arme robotisée effectue les fonctionnements introduisants à la pipette et la mise en chauffage est réglée par un ordinateur. Le dépistage en ligne par fluorescence induite par laser permet au système d'afficher la séquence directement dans un logiciel qui peut alors capter et analyser la séquence.

Électrophorèse capillaire

L'électrophorèse capillaire était un développement critique pour l'ordonnancement robotisé. Elle a été développée pendant les années 1990 et a remonté des gels de brame dans les systèmes de ordonnancement robotisés. Au lieu d'une brame, la modification de polyacrylamide remplit tube capillaire en verre et solution d'ADN injectés dans le capillaire. La solution de polyacrylamide alors est automatiquement remontée après chacun fait fonctionner pour régénérer le système. L'ordonnancement de capillaire est plus rapide et plus sensible pour l'ordonnancement. Des capillaires multiples ont été alors combinés pour ordonnancer en parallèle. Le format préféré a maintenant 96 fléaux capillaires.

Analyse de caractéristiques

L'ordonnancement d'ADN produit des données brutes pour les éclats dans l'échantillon. Les séquences d'éclat sont alors assemblées dans de plus longues séquences selon la nature du projet de ordonnancement. La pleine séquence a pu être un gène ou un génome entier. À cause de la complexité de cette analyse, elle exige beaucoup de pouvoir calculant. Les séquences répétitives peuvent être problématiques en plus grands éclats se réunissants ou pleins génomes. Elles peuvent entraîner des inexactitudes en assemblant la séquence. Il y a un certain nombre d'envois d'analyse de logiciel sur le marché qui fonctionnent avec les systèmes de ordonnancement robotisés.

Sources

[Davantage de relevé : Ordonnancement d'ADN]

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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