Automazione e preparato del campione per l'ordinamento di Sanger

L'ordinamento di Sanger è un DNA che ordina il metodo messo a punto da Fred Sanger nel 1977. La tecnica è basata sull'incorporazione dei dideoxynucleotides diterminazione dalla DNA polimerasi durante la replica di DNA. Ciò crea le lunghezze a catena del DNA che corrispondono ad ogni nucleotide. Queste sequenze possono poi essere separate facendo uso dell'elettroforesi del gel di poliacrilammide.

L'ordinamento di Sanger richiede un modello unico incagliato del DNA, mani di fondo del DNA per cominciare la replica, la DNA polimerasi, deoxynucleotriphosphates per costruire la catena e la catena-terminazione dei dideoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs). Le quattro reazioni d'ordinamento sono corrispondenza iniziata a ciascuno dei nucleotidi presenti in DNA: adenosina, guanina, citosina e timine.

Uno dei quattro dideoxynucleotides diterminazione si aggiunge ad ogni imbarcazione della reazione con gli altri materiali richiesti. Il replicazione del dna è iniziato, quindi l'imbarcazione della reazione è heated, separando le catene e raffreddato ancora in modo dalla reazione ricomincia con le mani di fondo fresche. La reazione è ciclata termicamente circa trentacinque volte e poi le catene risultanti sono separate parallelamente su un gel di poliacrilammide. Il risultato può “essere letto„ da sinistra a destra, longitudinale.

Preparato del campione

La qualità del modello del DNA è un fattore critico nel riuscito ordinamento di Sanger. Il DNA per l'ordinamento è clonato in un plasmide--un pezzo circolare di DNA che può poi essere usato per ampliare il modello. Il campione deve essere preparato con attenzione per evitare la contaminazione dal DNA genomico, dal RNA, o da altre sorgenti del DNA del non modello.

Clonato una volta in un plasmide, il modello è ampliato dalla PCR, è quantificato ed è diluito alla concentrazione desiderata per ordinare.

Automazione

Il Sanger che ordina il trattamento può essere laborioso effettuare a mano. Al giorno d'oggi, l'ordinamento di Sanger è automatizzato solitamente. Automated che ordina gli strumenti combina l'ordinamento con le mani di fondo o il dideoxy fluorescente contrassegnate terminatori a catena con l'acquisizione di dati dell'elettroforesi del gel di poliacrilammide e del computer.

Credito: mllejules/Shutterstock.com

Un braccio robot effettua le operazioni di prelevamento ed il riciclaggio termico è gestito da un computer. La rilevazione online dalla fluorescenza indotta da laser permette che il sistema legga la sequenza direttamente in un programma che può poi catturare ed analizzare la sequenza.

Elettroforesi capillare

L'elettroforesi capillare era uno sviluppo critico per l'ordinamento automatizzato. È stata sviluppata negli anni 90 ed ha sostituito i gel della bramma nei sistemi d'ordinamento automatizzati. Invece di una bramma, la matrice del poliacrilammide riempie un tubo capillare di vetro e la soluzione del DNA iniettati nel capillare. La soluzione del poliacrilammide poi è sostituita automaticamente dopo ciascuno funzionato per rinfrescare il sistema. L'ordinamento del capillare è più veloce e più sensibile per ordinare. I capillari multipli poi si sono combinati per l'ordinamento parallelamente. Il formato preferito ora ha 96 colonne capillari.

Analisi di dati

L'ordinamento del DNA redige i dati grezzi per i frammenti nel campione. Le sequenze del frammento poi sono montate nelle sequenze più lunghe secondo la natura del progetto d'ordinamento. La sequenza completa ha potuto essere un gene o un intero genoma. A causa della complessità di questa analisi, richiede moltissima potenza di calcolo. Le sequenze ripetitive possono essere problematiche in frammenti più grandi di montaggio o genoma completi. Possono causare le inesattezze quando monta la sequenza. Ci sono una serie di pacchetti dell'analisi del software sul servizio che funzionano con i sistemi d'ordinamento automatizzati.

Sorgenti

[Ulteriore lettura: Ordinamento del DNA]

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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