Preparação da automatização e da amostra para arranjar em seqüência de Sanger

Arranjar em seqüência de Sanger é um ADN que arranja em seqüência o método desenvolvido por Fred Sanger em 1977. A técnica é baseada na incorporação de dideoxynucleotides determinação pela polimerase de ADN durante a réplica do ADN. Isto cria os comprimentos chain do ADN que correspondem a cada nucleotide. Estas seqüências podem então ser separadas usando a electroforese do gel de polyacrylamide.

Arranjar em seqüência de Sanger exige um molde único-encalhado do ADN, primeiras demão do ADN para começar a réplica, polimerase de ADN, deoxynucleotriphosphates a construir a corrente, e a corrente-terminação de dideoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs). Quatro reacções arranjando em seqüência são correspondência começada a cada um dos nucleotides actuais no ADN: adenosina, guanina, cytosine, e thymine.

Um dos quatro dideoxynucleotides determinação é adicionado a cada embarcação da reacção junto com os outros materiais exigidos. A réplica do ADN é iniciada, a seguir a embarcação da reacção é caloroso, separando as correntes, e de refrigeração outra vez assim que a reacção reinicia com primeiras demão frescas. A reacção é dada um ciclo tèrmica aproximadamente trinta e cinco vezes, e as correntes resultantes são separadas então de lado a lado em um gel de polyacrylamide. O resultado pode “ser lido” da esquerda para a direita, de cima para baixo.

Preparação da amostra

A qualidade do molde do ADN é um factor crítico em arranjar em seqüência bem sucedido de Sanger. O ADN para arranjar em seqüência é clonado em um plasmídeo--uma parte circular de ADN que possa então ser usada para amplificar o molde. A amostra deve com cuidado ser preparada para evitar a contaminação pelo ADN genomic, pelo RNA, ou pelas outras fontes de ADN do não-molde.

Clonado uma vez em um plasmídeo, o molde é amplificado pelo PCR, dosado, e diluído à concentração desejada para arranjar em seqüência.

Automatização

O Sanger que arranja em seqüência o processo pode ser laborioso realizar-se à mão. Hoje em dia, arranjar em seqüência de Sanger é automatizado geralmente. Automatizado arranjando em seqüência instrumentos combine arranjar em seqüência com as primeiras demão ou o dideoxy fluorescente etiquetado os terminais chain com captação da electroforese do gel de polyacrylamide e de dados do computador.

Crédito: mllejules/Shutterstock.com

Um braço robótico realiza as operações introduzindo com pipeta e o ciclismo térmico é controlado por um computador. A detecção em linha pela fluorescência laser-induzida permite que o sistema leia a seqüência directamente em um programa de software que possa então capturar e analisar a seqüência.

Electroforese capilar

A electroforese capilar era uma revelação crítica para arranjar em seqüência automatizado. Foi desenvolvida nos anos 90 e substituiu geles da laje em sistemas arranjando em seqüência automatizados. Em vez de uma laje, a matriz do polyacrylamide enche uma câmara de ar capilar de vidro e a solução do ADN injetadas no capilar. A solução do polyacrylamide é substituída então automaticamente após cada um executado para refrescar o sistema. Arranjar em seqüência do capilar é mais rápido e mais sensível para arranjar em seqüência. Os capilares múltiplos foram combinados então arranjando em seqüência paralelamente. O formato preferido tem agora 96 colunas capilares.

Análise de dados

Arranjar em seqüência do ADN produz dados brutos para os fragmentos na amostra. As seqüências do fragmento são montadas então em umas seqüências mais longas segundo a natureza do projecto arranjando em seqüência. A seqüência completa podia ser um gene ou um genoma inteiro. Devido à complexidade desta análise, exige muita potência informática. As seqüências repetitivas podem ser problemáticas em fragmentos maiores de montagem ou em genomas completos. Podem causar irregularidades ao montar a seqüência. Há um número de pacotes da análise do software no mercado que trabalham com sistemas arranjando em seqüência automatizados.

Fontes

[Leitura adicional: Arranjar em seqüência do ADN]

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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