Preparación de la automatización y de la muestra para la secuencia de Sanger

La secuencia de Sanger es una DNA que ordena el método desarrollado por Fred Sanger en 1977. La técnica es basada en la incorporación de dideoxynucleotides cadena-terminales por la polimerasa de DNA durante la réplica de la DNA. Esto crea los largos de cadena de la DNA correspondiente a cada nucleótido. Estas series se pueden entonces separar usando electroforesis del gel de poliacrilamida.

La secuencia de Sanger requiere un patrón de una sola fila de la DNA, pinturas de fondo de la DNA para comenzar la réplica, polimerasa de DNA, deoxynucleotriphosphates para construir la cadena, y cadena-terminar los dideoxynucleosidetriphosphates (ddNTPs). Cuatro reacciones de secuencia se comienzan correspondiente a cada uno de los nucleótidos presentes en la DNA: adenosina, guanina, citosina, y thymine.

Uno de los cuatro dideoxynucleotides cadena-terminales se agrega a cada buque de la reacción junto con los otros materiales requeridos. Se inicia la réplica de la DNA, después el buque de la reacción es heated, separando las cadenas, y enfriado otra vez así que la reacción recomienza con las pinturas de fondo frescas. La reacción se completa un ciclo térmicamente cerca de treinta y cinco veces, y entonces las cadenas resultantes se separan de lado a lado en un gel de poliacrilamida. El resultado se puede “leer” de izquierda a derecha, de arriba a abajo.

Preparación de la muestra

La calidad del patrón de la DNA es un factor crítico en la secuencia acertada de Sanger. La DNA para ordenar se reproduce en un plásmido--un pedazo circular de DNA que se puede entonces utilizar para amplificar el patrón. La muestra se debe preparar cuidadosamente para evitar la contaminación por la DNA genomic, el ARN, u otras fuentes de la DNA del no-patrón.

Reproducido una vez en un plásmido, el patrón es amplificado por la polimerización en cadena, cuantificado, y diluido a la concentración deseada para ordenar.

Automatización

El Sanger que ordena proceso puede ser laborioso realizar a mano. Hoy en día, la secuencia de Sanger se automatiza generalmente. Automatizado ordenando los instrumentos combine la secuencia con las pinturas de fondo o dideoxy fluorescente etiqueta los adaptadores de cadena con recogida de la electroforesis del gel de poliacrilamida y de datos de la computador.

Haber: mllejules/Shutterstock.com

Una arma robótica realiza las operaciones que miden con una pipeta y el ciclaje térmico es controlado por una computador. La detección en línea por fluorescencia inducida por láser permite que el sistema lea la serie directamente en un programa informático que pueda después capturar y analizar la serie.

Electroforesis capilar

La electroforesis capilar era un revelado crítico para la secuencia automatizada. Fue desarrollada en los años 90 y ha reemplazado los geles de la plancha en sistemas de secuencia automatizados. En vez de una plancha, la matriz de la poliacrilamida llena un tubo capilar de cristal y la solución de la DNA inyectados en el capilar. La solución de la poliacrilamida entonces se reemplaza automáticamente después de cada uno ejecutada para repasar el sistema. La secuencia del capilar es más rápida y más sensible para ordenar. Los capilares múltiples entonces fueron combinados para ordenar paralelamente. El formato preferido ahora tiene 96 olumnas capilares.

Análisis de datos

La secuencia de la DNA presenta las informaciones en bruto para los fragmentos en la muestra. Las series del fragmento entonces se montan en series más largas dependiendo de la naturaleza del proyecto de secuencia. La serie completa podía ser un gen o un genoma entero. Debido a la complejidad de este análisis, requiere mucho poder de computación. Las series repetidores pueden ser problemáticas en fragmentos más grandes de montaje o genomas completos. Pueden causar inexactitudes al montar la serie. Hay varios empaquetar del análisis del software en el mercado que trabajan con los sistemas de secuencia automatizados.

Fuentes

[Lectura adicional: Secuencia de la DNA]

Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Catherine Shaffer

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Dr. Catherine Shaffer

Catherine Shaffer is a freelance science and health writer from Michigan. She has written for a wide variety of trade and consumer publications on life sciences topics, particularly in the area of drug discovery and development. She holds a Ph.D. in Biological Chemistry and began her career as a laboratory researcher before transitioning to science writing. She also writes and publishes fiction, and in her free time enjoys yoga, biking, and taking care of her pets.

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