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Bruit de fond dans les taches occidentales

Les analyses occidentales de tache sont une technique populaire employée pour analyser l'expression de la protéine en déterminant le poids moléculaire de protéines, leurs modifications goujon-de translation, et leur abondance.

LSINITAR | Shutterstock

La clavette à une tache occidentale couronnée de succès réalise un rapport de signal-bruit permettant le dépistage des protéines tout en réduisant à un minimum le bruit de fond. Le bruit de fond élevé peut avoir plusieurs causes et solutions associées.

Éditions de dépistage

Sélecter l'anticorps droit

Un fond élevé uniforme est quand la tache entière est sombre, qui a comme conséquence lui étant plus dur pour voir les bandes spécifiques. Les éditions de dépistage peuvent être dues aux fortes concentrations d'anticorps, qui aboutit à saturation et couche de la membrane et ainsi du grippement non spécifique. Ceci peut être résolu en réduisant la concentration en anticorps par l'intermédiaire d'un test de point-tache pour trouver la concentration optimale en anticorps.

Durée d'exposition

Un autre problème a associé aux éditions de dépistage qui peuvent mener au bruit de fond uniforme élevé sont quand la membrane est surexposée. Si les durées d'exposition sont augmentées, il peut améliorer le mouvement propre général sans augmenter la sensibilité. Ceci peut être fixé en réglant les paramètres d'exposition et en employant plus peu de durée d'exposition.

Sélecter une membrane de bonne qualité

D'autres solutions comprennent charger plus de protéines, dans le but d'augmenter l'abondance de l'antigène d'objectif, de titrer le puits primaire d'anticorps et d'essayer un anticorps primaire différent s'il y a plusieurs solutions de rechange procurables.

D'autres éditions peuvent être provoquées par la membrane elle-même. Certaines membranes sont considérées comme donneres plus de bruit de fond que d'autres. Par exemple, des membranes de nitrocellulose sont généralement pensées pour donner moins de mouvement propre que les membranes de difluoride de polyvinylidène (PVDF). Cependant, les membranes de PVDF ont une capacité de liaison élevée, alors que les membranes de nitrocellulose tendent à être cassantes et souvent ne grippent pas de plus petites protéines.

Le choix de membrane devrait être fait a basé sur des caractéristiques empiriques pour chaque combinaison d'antigène-anticorps. En outre, une membrane desséchée ou vieille qui a réussi sa date d'expiration peut contribuer au fond élevé.

Stockage d'anticorps

Parfois, l'activité obligatoire de l'anticorps peut être insuffisante. Ceci se produit généralement si traiter et le stockage des anticorps étaient inadéquats. Par exemple, des anticorps de dégel et à plusieurs reprises de congélation devraient être évités.

Chaque fois que une tache occidentale est préparée, une partie aliquote fraîche de l'anticorps qui a été enregistré au °C -20 devrait être employée. Si des anticorps doivent être enregistrés pendant de longues périodes, on lui recommande qu'ils soient enregistrés au °C -80 pour rester stables.

Émissions par série

Le fond élevé uniforme peut également être provoqué par les émissions par série, blocage particulièrement insuffisant de la membrane.

La membrane bloquant la liaison non spécifique d'arrêts de l'anticorps à la membrane et est faite en incubant la tache avec un tampon de blocage. En soi, la température et la longueur de l'incubation peuvent affecter la réussite de la membrane bloquant et les deux peuvent être augmentés en cas du blocage insuffisant de membrane.

Le blocage normal est fait pour 1 heure à la température ambiante avec l'agitation, ou du jour au lendemain à 4°C avec l'agitation. En outre, le type et la concentration de bloquer le réactif peuvent affecter sa réussite. Le type de bloquer le réactif pour employer dépend de l'interaction entre l'antigène et l'anticorps, mais un premier choix courant est lait en poudre sans matières grasses.

Type, on lui recommande de commencer aux concentrations en 1% ou en 5% du lait. Si l'anticorps ou le système de dépistage est incompatible avec du lait, l'albumine de sérum de boeuf de 3% (BSA) est employée souvent.

Une autre émission par série qui peut mener au fond élevé uniforme sont des réactions entre les agents de blocage et les anticorps, ayant pour résultat l'interférence. Si l'agent de blocage est à base de protéines, les anticorps peuvent gripper à ces protéines et entraîner le mouvement propre uniforme élevé. Par exemple, le sérum animal avec des anticorps primaires non épurés peut gripper aux protéines animales pour bloquer des réactifs.

Comme mentionné précédemment, certains réactifs de blocage sont inappropriés pour certains systèmes de dépistage - le lait contient la biotine, et peut réagir avec l'avadin quand un système de dépistage d'avadin-biotine est employé. Si ni le lait en poudre sans matières grasses ni l'albumine de sérum de boeuf ne conviennent, la protéine sans protéines ou de non-animal bloquant des réactifs sont fournie par quelques détaillants. Alternativement, un contrôle secondaire manquant de l'anticorps primaire peut être fait fonctionner.

Éditions de contamination

Pour finir, la contamination peut entraîner le fond élevé dans des analyses occidentales de tache. La contamination peut se produire en bloquant les solutions sont réutilisées, qui elles devraient ne jamais être. Une alternative est d'employer la protéine pure comme agent de blocage. En outre, les tampons qui contiennent le détergent et le lait peuvent introduire la croissance bactérienne et devraient, pour cette raison, être rendus frais pour éviter la contamination bactérienne.

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Last Updated: Apr 5, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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Comments

  1. Wende DeBray Davis Wende DeBray Davis United States says:

    So as a patient that received results that stated my value was High Background, how do I proceed? And does this mean my western blot was done incorrectly?

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.