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Rumore di fondo nelle macchie occidentali

Le analisi occidentali della macchia sono una tecnica popolare usata per analizzare l'espressione della proteina determinando il peso molecolare delle proteine, le loro modifiche post-di traduzione e la loro abbondanza.

Ottenere un buon rapporto segnale-rumore nel macchiare occidentale è essenzialeSINITAR | Shutterstock

Il tasto ad una riuscita macchia occidentale sta raggiungendo un rapporto di segnale/disturbo permettendo la rilevazione delle proteine mentre minimizzava il rumore di fondo. L'alto rumore di fondo può avere parecchie cause e soluzioni associate.

Emissioni di rilevazione

Selezionare l'anticorpo giusto

Un alto sfondo costante è quando l'intera macchia è scurita, che provoca che è più duro da vedere le bande specifiche. Le emissioni di rilevazione possono essere dovuto le alte concentrazioni di anticorpi, che piombo a saturazione ed al rivestimento della membrana e così dell'associazione non specifica. Ciò può essere risolta diminuendo la concentrazione nell'anticorpo via una prova della punto-macchia per trovare la concentrazione ottimale nell'anticorpo.

Tempo di esposizione

Un altro problema si è riferito alle emissioni di rilevazione che possono piombo ad alto rumore di fondo costante sono quando la membrana è sovresposta. Se i tempi di esposizione sono aumentati, può migliorare i precedenti globali senza aumentare la sensibilità. Ciò può essere fissata la regolazione dei parametri dell'esposizione ed usando un tempo di esposizione di scarsità.

Selezionare una membrana di buona qualità

Altre soluzioni comprendono il carico delle più proteine, allo scopo di aumento dell'abbondanza dell'antigene dell'obiettivo, la titolazione del pozzo primario dell'anticorpo e provare un anticorpo primario differente se ci sono parecchie alternative disponibili.

Altre emissioni possono essere causate dalla membrana stessa. Determinate membrane sono considerate di dare più rumore di fondo che altri. Per esempio, le membrane della nitrocellulosa sono pensate generalmente per dare meno contesto che le membrane di difluoruro del polivinilidene (PVDF). Tuttavia, le membrane di PVDF hanno un'alta capacità obbligatoria, mentre le membrane della nitrocellulosa tendono ad essere friabili e spesso non legano le più piccole proteine.

La selezione della membrana dovrebbe essere fatta in base ai dati empirici per ogni combinazione dell'antigene-anticorpo. Ancora, una membrana asciugata o vecchia che ha passato la sua data di scadenza può contribuire all'alto sfondo.

Stoccaggio dell'anticorpo

A volte, l'attività obbligatoria dell'anticorpo può essere insufficiente. Ciò accade generalmente se la manipolazione e lo stoccaggio degli anticorpi fossero inadeguati. Per esempio, gli anticorpi di disgelo e ripetutamente di congelamento dovrebbero essere evitati.

Ogni volta una macchia occidentale è preparata, un'aliquota fresca dell'anticorpo che è stato memorizzato a °C -20 dovrebbe essere usata. Se gli anticorpi devono essere memorizzati per i lungi periodi, è raccomandato che siano memorizzati a °C -80 per rimanere stabili.

Emissioni di didascalia

L'alto sfondo costante può anche essere causato dalle emissioni di didascalia, didascalia specificamente insufficiente della membrana.

La didascalia della membrana ferma il legame non specifico dell'anticorpo alla membrana ed è fatta incubando la macchia con un buffer di didascalia. Come tale, sia la temperatura che la lunghezza dell'incubazione possono pregiudicare il successo della didascalia della membrana ed entrambi possono essere aumentati in caso di didascalia insufficiente della membrana.

La didascalia standard è fatta per 1 ora alla temperatura ambiente con agitazione, o durante la notte a 4°C con agitazione. Ancora, il tipo e la concentrazione di reagente di didascalia possono pregiudicare il suo successo. Il tipo di reagente di didascalia da usare dipende dall'interazione fra l'antigene e l'anticorpo, ma una scelta iniziale comune è latte in polvere senza grassi.

Tipicamente, è raccomandato per cominciare alle concentrazioni in 5% o in 1% di latte. Se l'anticorpo o il sistema di rilevamento è incompatibile con latte, l'albumina di siero bovino di 3% (BSA) è usata spesso.

Un'altra emissione di didascalia che può piombo all'alto sfondo costante è le reazioni fra gli agenti bloccanti e gli anticorpi, con conseguente interferenza. Se l'agente bloccante è a base di proteine, gli anticorpi possono legare a quelle proteine e causare l'alto sfondo costante. Per esempio, il siero animale con gli anticorpi primari non purificati può legare alle proteine animali in reagenti di didascalia.

Come citato precedentemente, determinati reagenti di didascalia sono inadatti per determinati sistemi di rilevamento - il latte contiene la biotina e può reagire con avadin quando un sistema di rilevamento della avadin-biotina è utilizzato. Se nè il latte in polvere senza grassi nè l'albumina di siero bovino è adatta, i reagenti senza proteine o non animali di didascalia della proteina sono disponibili da alcuni rivenditori. Alternativamente, un controllo secondario che manca dell'anticorpo primario può essere funzionato.

Emissioni di contaminazione

Infine, la contaminazione può causare l'alto sfondo nelle analisi occidentali della macchia. La contaminazione può accadere quando blocca le soluzioni è riutilizzata, che dovrebbero mai non essere. Un'alternativa è di usare la proteina pura come agente bloccante. Ancora, i buffer che contengono il detersivo ed il latte possono promuovere la crescita batterica e dovrebbero, quindi, essere resi fresco per evitare la contaminazione batterica.

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Last Updated: Apr 5, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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    Ryding, Sara. (2019, April 05). Rumore di fondo nelle macchie occidentali. News-Medical. Retrieved on April 23, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Background-Noise-in-Western-Blots.aspx.

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Comments

  1. Wende DeBray Davis Wende DeBray Davis United States says:

    So as a patient that received results that stated my value was High Background, how do I proceed? And does this mean my western blot was done incorrectly?

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.