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Ruído de fundo em manchas ocidentais

Os ensaios ocidentais da mancha são uma técnica popular usada para analisar a expressão da proteína determinando o peso molecular das proteínas, suas alterações cargo-translational, e sua abundância.

Obter uma boa relação de relação sinal-ruído na mancha ocidental é essencialSINITAR | Shutterstock

A chave a uma mancha ocidental bem sucedida está conseguindo um sinal à relação de ruído permitindo a detecção de proteínas ao minimizar o ruído de fundo. O ruído de fundo alto pode ter diversas causas e soluções associadas.

Edições da detecção

Selecionando o anticorpo direito

Um fundo alto uniforme é quando a mancha inteira é escurecida, que conduz a ele que é mais duro considerar faixas específicas. As edições da detecção podem ser devido às concentrações altas de anticorpos, que conduz à saturação e ao revestimento da membrana e assim do emperramento não específico. Isto pode ser resolvido reduzindo a concentração do anticorpo através de um teste da ponto-mancha para encontrar a concentração óptima do anticorpo.

Tempo de exposição

Um outro problema relacionou-se às edições da detecção que podem conduzir ao ruído de fundo uniforme alto são quando a membrana overexposed. Se os tempos de exposição são aumentados, pode aumentar o fundo total sem aumentar a sensibilidade. Isto pode ser fixado ajustando os parâmetros da exposição e usando uma estadia de exposição mais curto.

Selecionando uma membrana da boa qualidade

Outras soluções incluem o carregamento de mais proteínas, com o objectivo de aumentar a abundância do antígeno do alvo, de titrating o poço preliminar do anticorpo e de tentar um anticorpo preliminar diferente se há diversas alternativas disponíveis.

Outras edições podem ser causadas pela membrana própria. Determinadas membranas são consideradas dar mais ruído de fundo do que outro. Por exemplo, as membranas da nitrocelulose são pensadas geralmente para dar menos fundo do que as membranas do difluoride do polyvinylidene (PVDF). Contudo, as membranas de PVDF têm uma capacidade de ligação alta, quando as membranas da nitrocelulose tenderem a ser frágeis e frequentemente não ligarem proteínas menores.

A selecção da membrana deve ser feita com base em dados empíricos para cada combinação do antígeno-anticorpo. Além disso, uma membrana secada ou velha que passe sua data de validade pode contribuir ao fundo alto.

Armazenamento do anticorpo

Às vezes, a actividade obrigatória do anticorpo pode ser insuficiente. Isto ocorre geralmente se a manipulação e o armazenamento dos anticorpos eram impróprios. Por exemplo, os anticorpos thawing e repetidamente de congelação devem ser evitados.

Cada vez que uma mancha ocidental é preparada, uma parte alíquota fresca do anticorpo que foi armazenado no °C -20 deve ser usada. Se os anticorpos devem ser armazenada por longos período, recomenda-se que estejam armazenados no °C -80 para permanecer estáveis.

Edições de obstrução

O fundo alto uniforme pode igualmente ser causado por edições de obstrução, obstrução especificamente insuficiente da membrana.

A membrana que obstrui o emperramento não específico das paradas do anticorpo à membrana e é feita incubando a mancha com um amortecedor de obstrução. Como tal, a temperatura e o comprimento da incubação podem afectar o sucesso da membrana que obstrui e ambos podem ser aumentados no caso da insuficiente obstrução da membrana.

A obstrução padrão é feita para 1 hora na temperatura ambiente com agitação, ou durante a noite em 4°C com agitação. Além disso, o tipo e a concentração de obstruir o reagente podem afectar seu sucesso. O tipo de obstruir o reagente para usar-se depende da interacção entre o antígeno e o anticorpo, mas uma escolha inicial comum é leite seco não-gordo.

Tipicamente, recomenda-se começar em concentrações de 1% ou de 5% de leite. Se o anticorpo ou o sistema de detecção são incompatível com leite, a albumina de soro bovino de 3% (BSA) é usada frequentemente.

Uma outra edição de obstrução que possa conduzir ao fundo alto uniforme é reacções entre agentes de obstrução e anticorpos, tendo por resultado a interferência. Se o agente de obstrução é proteína baseada, os anticorpos podem ligar 2 aquelas proteínas e causar o fundo uniforme alto. Por exemplo, o soro animal com os anticorpos preliminares unpurified pode ligar às proteínas animais em obstruir reagentes.

Como mencionado previamente, determinados reagentes de obstrução são com certeza sistemas de detecção inoportunos - o leite contem a biotina, e pode reagir com o avadin quando um sistema de detecção da avadin-biotina é usado. Se nem o leite seco não-gordo nem a albumina de soro bovino são apropriado, a proteína proteína-livre ou não animal que obstrui reagentes está disponível de alguns varejistas. Alternativamente, um controle secundário que falta o anticorpo preliminar pode ser executado.

Edições da contaminação

Última, a contaminação pode causar o fundo alto em ensaios ocidentais da mancha. A contaminação pode ocorrer ao obstruir as soluções é reúso, que devem nunca ser. Uma alternativa é usar a proteína pura como um agente de obstrução. Além disso, os amortecedores que contêm o detergente e o leite podem promover o crescimento bacteriano e devem, conseqüentemente, ser feitos fresco para evitar a contaminação bacteriana.

Fontes

Further Reading

Last Updated: Apr 5, 2019

Sara Ryding

Written by

Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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    Ryding, Sara. (2019, April 05). Ruído de fundo em manchas ocidentais. News-Medical. Retrieved on April 19, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/Background-Noise-in-Western-Blots.aspx.

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Comments

  1. Wende DeBray Davis Wende DeBray Davis United States says:

    So as a patient that received results that stated my value was High Background, how do I proceed? And does this mean my western blot was done incorrectly?

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.