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Ruido de fondo en manchas blancas /negras occidentales

Los análisis occidentales de la mancha blanca /negra son una técnica popular usada para analizar la expresión de la proteína determinando el peso molecular de proteínas, sus modificaciones poste-de translación, y su abundancia.

La obtención de un buen ratio señal/ruido en borrar occidental es esencialSINITAR | Shutterstock

La llave a una mancha blanca /negra occidental acertada está logrando una relación señal-ruido permitiendo la detección de proteínas mientras que disminuye el ruido de fondo. El ruido de alto fondo puede tener varias causas y soluciones asociadas.

Entregas de la detección

Selección del anticuerpo derecho

Un alto fondo uniforme es cuando se oscurece la mancha blanca /negra entera, que da lugar a él que es más duro considerar bandas específicas. Las entregas de la detección pueden ser debido a las altas concentraciones de anticuerpos, que lleva a la saturación y a la capa de la membrana y así del atascamiento no específico. Esto puede ser resuelta reduciendo la concentración del anticuerpo vía una prueba de la punto-mancha blanca /negra para encontrar la concentración óptima del anticuerpo.

Tiempo de exposición

Otro problema se relacionó con las entregas de la detección que pueden llevar al ruido de fondo del uniforme del alto son cuando se sobreexpone la membrana. Si se aumentan los tiempos de exposición, puede aumentar el fondo total sin el aumento de la sensibilidad. Esto puede ser reparada ajustando los parámetros de la exposición y usando un rato de una exposición más corta.

Selección de una membrana de la buena calidad

Otras soluciones incluyen cargar más proteínas, con el objetivo de aumentar la abundancia del antígeno del objetivo, de titular el pozo primario del anticuerpo y de intentar un diverso anticuerpo primario si hay varias opciones disponibles.

Otras entregas se pueden causar por la membrana sí mismo. Ciertas membranas se consideran dar más ruido de fondo que otros. Por ejemplo, las membranas de la nitrocelulosa se piensan generalmente para dar menos fondo que las membranas del difluoride del polivinilideno (PVDF). Sin embargo, las membranas de PVDF tienen una alta capacidad de enlace, mientras que las membranas de la nitrocelulosa tienden a ser quebradizas y no atan a menudo proteínas más pequeñas.

La selección de la membrana se debe hacer sobre la base de los datos empíricos para cada combinación del antígeno-anticuerpo. Además, una membrana desecada o vieja que ha pasado su fecha de vencimiento puede contribuir al alto fondo.

Almacenamiento del anticuerpo

A veces, la actividad obligatoria del anticuerpo puede ser escasa. Esto ocurre generalmente si el manejo y el almacenamiento de anticuerpos eran inadecuados. Por ejemplo, los anticuerpos que descongelan y en varias ocasiones de congelaciones deben ser evitados.

Cada vez que se prepara una mancha blanca /negra occidental, una parte alícuota fresca del anticuerpo que se ha salvado en el °C -20 debe ser utilizada. Si se van los anticuerpos a ser salvados por largos periodos, se recomienda que estén salvados en el °C -80 para seguir siendo estables.

Entregas que ciegan

El alto fondo uniforme se puede también causar por las entregas que ciegan, el cegar específicamente escaso de la membrana.

La membrana que ciega el atascamiento no específico de los paradas del anticuerpo a la membrana y es hecha incubando la mancha blanca /negra con un almacenador intermedio que ciega. Como tal, la temperatura y el largo de la incubación pueden afectar al éxito de la membrana que ciega y ambos se pueden aumentar en caso de cegar escaso de la membrana.

El cegar estándar se hace para 1 hora en la temperatura ambiente con la agitación, o durante la noche en 4°C con la agitación. Además, el tipo y la concentración de cegar el reactivo pueden afectar a su éxito. El tipo de cegar el reactivo para utilizar depende de la acción recíproca entre el antígeno y el anticuerpo, pero una opción inicial común es leche seca sin materias grasas.

Típicamente, se recomienda para comenzar en las concentraciones del 1% o del 5% de leche. Si el anticuerpo o el sistema de detección es incompatible con leche, la albúmina del suero vacuno del 3% (BSA) es de uso frecuente.

Otra entrega que ciega que puede llevar para uniformar el alto fondo es reacciones entre los agentes de bloqueo y los anticuerpos, dando por resultado interferencia. Si el agente de bloqueo es a base de proteínas, los anticuerpos pueden atar a esas proteínas y causar a alto el fondo uniforme. Por ejemplo, el suero animal con los anticuerpos primarios sin purificar puede atar a las proteínas animales en cegar los reactivos.

Según lo mencionado previamente, ciertos reactivos que ciegan son con certeza sistemas de detección inadecuados - la leche contiene la biotina, y puede reaccionar con el avadin cuando se utiliza un sistema de detección de la avadin-biotina. Si ni la leche seca sin materias grasas ni la albúmina del suero vacuno es conveniente, la proteína sin proteína o no animal que ciega los reactivos está disponible de algunos minoristas. Alternativamente, un mando secundario que falta el anticuerpo primario puede ser ejecutado.

Entregas de la contaminación

Pasado, la contaminación puede causar el alto fondo en análisis occidentales de la mancha blanca /negra. Se reutiliza la contaminación puede ocurrir al cegar las soluciones, que deben nunca ser. Una opción es utilizar la proteína pura como agente de bloqueo. Además, los almacenadores intermedios que contienen el detersorio y la leche pueden ascender incremento bacteriano y se deben, por lo tanto, hacer fresco para evitar la contaminación bacteriana.

Fuentes

Further Reading

Last Updated: Apr 5, 2019

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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Comments

  1. Wende DeBray Davis Wende DeBray Davis United States says:

    So as a patient that received results that stated my value was High Background, how do I proceed? And does this mean my western blot was done incorrectly?

The opinions expressed here are the views of the writer and do not necessarily reflect the views and opinions of News Medical.