Complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC)

La complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC) est une technique récente utilisée dans l'enquête et la visualisation directe des interactions protéine-protéine (PPIs) et interaction entre les protéines et d'autres macromolécules qui sont essentielles pour la survie des cellules. L'identification de ces rapports spécifie leur fonctionner à l'intérieur des cellules en bref. Les organismes avec des réseaux de PPI comprennent des êtres humains, des vis sans fin, la levure, et des centrales.

Crédit : Karl Dupont/Shutterstock.com

BiFC est principalement employé dans des études de la taille du génome de PPIs ; il est recensé comme technique efficace en découvrant des interactions de protéines neuves, et en fournissant des informations nouvelles sur des fonctionnements de protéine.

Principe de BiFC

Le principe de fonctionnement de BiFC est basé sur le développement d'un composé fluorescent, en raison de l'association de deux segments d'une protéine fluorescente quand ils sont dans la grande proximité due à l'interaction protéine-protéine dans les éclats, c.-à-d., dans BiFC, un fluorophore est divisé en extrémités terminales aminées et carboxyliques. Ces extrémités sont combinées dans deux protéines. Quand ces deux protéines agissent l'un sur l'autre, les les deux les segments rassocient ayant pour résultat la réforme du fluorophore et de la fluorescence aux sites de la surface adjacente.

Ensemble de règles pour concevoir BiFC

Les expériences de BiFC - pendant qu'il est basé sur l'interaction entre les segments fluorescents de protéine - a lieu seulement dans certaines circonstances. L'analyse de BiFC concerne une analyse qui est fabriquée de telle manière qu'elle réponde à tous les paramètres affectant l'association des segments fluorescents de protéine. La procédure de la fabrication d'analyse comprend :

Étalonnage de BiFC

L'étalonnage de BiFC est effectué dans quatre étapes comme suit :

  1. Le choix de fluorophore approprié qui fonctionne finement comme synthèse de BiFC partners. Les exemples des fluorophores sont Vénus et protéine fluorescente jaune (YFP).
  2. Le marquage des protéines en lesquelles le BiFC segmente sont collés sur l'aminé ou les carboxylique-bornes de la protéine sélectée.
  3. Détermination des circonstances de transfection avant le contrôle des mutants multiples.
  4. La détermination des modifications qui se produisent dans la localisation des protéines dues à l'ajout de BiFC segmente.

Transfection de placage et de cellules

Dans ce procédé, les cellules sont au commencement plaquées dans une embase en verre et dans deux puits d'une plaque de 6 puits et alors elles sont permises d'arranger du jour au lendemain à la température ambiante. Alors la cellule ADN sont disposées pour le procédé de transfection. À la fin du procédé de transfection, la combinaison est divisée également et alors incubée à la température ambiante pendant quelques heures. Les medias de transfection est retirés et alors incubés de nouveau à l'état de chambre.

Préparation des cellules pour la représentation

Dans ce procédé, les cellules s'analysent au commencement utilisant un microscope epifluorescent afin de vérifier leur fluorescence. Puis, la préparation des cellules est faite par l'ajout du paraformaldéhyde après quoi les cellules sont lysées pour obtenir l'image.

Représentation des cellules

L'intensité de la fluorescence est déterminée pour chaque cellule. L'analyse sélectrice des signes de BiFC est réalisée en effectuant la transfection avec la PCP. La représentation est faite utilisant un microscope confocal.

Quantitation de fluorescence

La mesure de l'intensité de la fluorescence fait utilisant des plusieurs logiciel de représentation.

Analyse des caractéristiques

Les rendements de la complémentation de fluorescence sont déterminés par la valeur obtenue par la division des intensités de la complémentation de fluorescence et des intensités de la protéine fluorescente entière en chaque cellule.

Modèle d'expérience en couleurs de BiFC

L'expérience en couleurs de BiFC comporte la combinaison des associés substitutional et des segments des protéines fluorescentes qui fournissent des composés avec différentes bandes de couleur. La représentation séquentielle est réalisée par la visualisation des composés concernant des longueurs d'onde distinctes d'émission et d'excitation. La représentation des composés est faite alternativement pour éviter la re-localisation de l'un ou l'autre de composé basé sur le retard entre la représentation des composés.

Les intensités de fluorescence devraient être mises à jour à la grandeur continuelle afin d'éviter le développement de la variation des distributions provoquées par variation dans le rapport de signe-à-mouvement propre. Les bruits entre deux fluorophores peuvent également être rectifiés par la représentation les cellules qui représentent seulement un groupe de protéines.  

BiFC en couleurs a été déterminé la première fois en cellules mammifères dans les études que des combinaisons variées utilisées de YFP et de PCP. BiFC s'arrange pour examiner les efficacités relatives de l'interaction de bFos avec le bJun et le bATF2.

L'amélioration d'une méthode en couleurs de BiFC pour des cellules de centrale aide dans l'enquête sur le développement simultané des composés alternatifs de détecteur/protéine kinase de calcium dans le planta.

Applications de l'analyse de BiFC

Les applications de BiFC comprennent la représentation de la distribution équilibrée des composés développés par le groupement des protéines dans types variés des cellules et d'organismes. Elle active également la représentation des interactions entre les protéines multiples dans une cellule en plus de l'altération dans les protéines covalentes qui fournissent les informations complémentaires au sujet des procédés biologiques des composés de protéine qui sont récent produits.

Il est également utile dans l'identification des segments variés de protéine qui peuvent être combinés par l'interaction entre les protéines qui sont collées sur les segments qui comprennent la β-galactosidase, l'ubiquitine, et la réductase de dihydrofolate. Les expériences de BiFC sont également utiles dans la détermination de la topologie des protéines de membrane et de l'inspection élevée d'entrée et sortie de légers effets moléculaires sur les composés de protéine.

Last Updated: Feb 26, 2019

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