Complementazione bimolecolare di fluorescenza (BiFC)

La complementazione bimolecolare della fluorescenza (BiFC) è una tecnica recente utilizzata nella ricerca e nella visualizzazione diretta delle interazioni della proteina-proteina (PPIs) ed interazione fra le proteine ed altre macromolecole che sono essenziali per la sopravvivenza delle celle. L'identificazione di queste relazioni specifica il loro lavoro dentro le celle in breve. Gli organismi con le reti di PPI includono gli esseri umani, i vermi, il lievito e gli impianti.

Credito: Carl Du Pont/Shutterstock.com

BiFC pricipalmente è utilizzato negli studi genoma di ampiezza di PPIs; è identificato come efficace tecnica nello scoprire le nuove interazioni della proteina e nel fornire informazioni novelle sulle funzioni di proteina.

Principio di BiFC

Il principio di funzionamento di BiFC è basato sullo sviluppo di un complesso fluorescente, come conseguenza dell'associazione di due segmenti di una proteina fluorescente quando sono nella grande prossimità dovuto interazione della proteina-proteina nei frammenti, cioè, in BiFC, un fluorophore è diviso nelle estremità terminali amminiche e carbossiliche. Queste estremità si combinano in due proteine. Quando queste due proteine interagiscono, gli entrambi segmenti si riassociano con conseguente riforma del fluorophore e della fluorescenza ai siti dell'interfaccia.

Insieme delle norme per progettare BiFC

Gli esperimenti di BiFC - mentre è basato sull'interazione fra i segmenti fluorescenti della proteina - ha luogo soltanto in determinate circostanze. L'analisi di BiFC comprende un'analisi che da costruzione in tal modo che soddisfa tutti i parametri che pregiudicano l'associazione dei segmenti fluorescenti della proteina. La procedura di montaggio di analisi include:

Calibratura di BiFC

La calibratura di BiFC è effettuata in quattro fasi come segue:

  1. La selezione di fluorophore appropriato che funziona con precisione come sintesi di BiFC partners. Gli esempi dei fluorophores sono Venere e proteina fluorescente gialla (YFP).
  2. Il contrassegno delle proteine in cui il BiFC segmenta è saldato all'amminico o a dei carbossilico-terminali della proteina selezionata.
  3. Determinazione delle circostanze di transfezione prima della prova dei mutanti multipli.
  4. La determinazione dei cambiamenti che si presentano nella localizzazione delle proteine dovuto l'aggiunta di BiFC segmenta.

Transfezione delle cellule e di placcatura

In questo trattamento, le celle inizialmente sono placcate in una lastra grossa inferiore di vetro ed in due pozzi di una lastra grossa di 6 pozzi e poi sono permesse sistemarsi durante la notte alla temperatura ambiente. Poi la cella DNAs è preparata per il trattamento di transfezione. Dopo il completamento del trattamento di transfezione, la combinazione è divisa ugualmente e poi è incubata alla temperatura ambiente per alcune ore. Poi i media di transfezione è eliminato ed incubato ancora una volta allo stato della stanza.

Preparato delle celle per rappresentazione

In questo trattamento, le celle inizialmente sono analizzate facendo uso di un microscopio epifluorescent per controllare la loro fluorescenza. Poi, il preparato delle celle è fatto mediante l'aggiunta di paraformaldeide dopo di che le celle sono fatte l'elettrolisi per ottenere l'immagine.

Rappresentazione delle celle

L'intensità della fluorescenza è risoluta per ogna singolo cella. L'analisi selettiva dei segnali di BiFC è raggiunta eseguendo la transfezione con il CFP. La rappresentazione è fatta facendo uso di un microscopio confocale.

Quantificazione di fluorescenza

La misura dell'intensità della fluorescenza fa facendo uso dei parecchi software della rappresentazione.

Analisi dei dati

I risparmi di temi di complementazione della fluorescenza sono determinati dal valore ottenuto da divisione delle intensità di complementazione della fluorescenza e delle intensità di intera proteina fluorescente in ogni cella.

Progettazione dell'esperimento multicolore di BiFC

L'esperimento multicolore di BiFC comprende la combinazione di partner substitutional e dei segmenti delle proteine fluorescenti che rendono i composti con differenti bande di colore. La rappresentazione sequenziale è raggiunta da visualizzazione dei composti che comprendono le lunghezze d'onda distinte di eccitazione e dell'emissione. La rappresentazione dei composti è fatta alternativamente per impedire la ri-localizzazione di qualsiasi composto basato sul ritardo fra la rappresentazione dei composti.

Le intensità della fluorescenza dovrebbero essere mantenute a grandezza costante per impedire lo sviluppo della variazione nelle distribuzioni causate tramite la variazione nel rapporto di segnale--sfondo. Le perturbazioni fra due fluorophores possono anche essere rettificate dalla rappresentazione le celle che rappresentano soltanto un gruppo di proteine.  

BiFC multicolore in primo luogo è stato stabilito in cellule di mammiferi negli studi che varie combinazioni usate di YFP e di CFP. BiFC inventa per esaminare le efficacie relative di interazione di bFos con bJun e bATF2.

Il miglioramento di un metodo multicolore di BiFC per le cellule vegetali aiuta nell'indagine sullo sviluppo simultaneo dei complessi alternativi del sensore/chinasi proteica del calcio in planta.

Applicazioni dell'analisi di BiFC

Le applicazioni di BiFC comprendono la rappresentazione di distribuzione dello costante-stato dei composti sviluppati raggruppando delle proteine in vari tipi di celle e di organismi. Egualmente permette alla rappresentazione delle interazioni fra le proteine multiple in un unicellulare oltre alle alterazioni nelle proteine covalenti che forniscono l'ulteriore informazione circa i trattamenti biologici dei composti della proteina che recentemente sono incontrati.

È egualmente utile nell'identificazione di vari segmenti della proteina che possono combinarsi dall'interazione fra le proteine che sono saldate ai segmenti che includono la β-galattosidasi, il ubiquitin e la riduttasi del dihydrofolate. Gli esperimenti di BiFC sono egualmente utili nella determinazione di topologia delle proteine della membrana e di alta ispezione dell'output e dell'input di leggeri effetti molecolari sui composti della proteina.

Sorgenti

  1. http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2012/November/Bimolecular-fluorescence-complementation-BiFC-A-5-year-update-and-future-perspectives/biotechniques-337088.html?pageNum=1
  2. http://www.vanderbilt.edu/cbi/Presentations/EmPresentation.pdf
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2829326/
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3169261/
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2829326/
  6. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-313X.2008.03612.x/pdf
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2518326/

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Last Updated: Feb 26, 2019

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