Complementação bimolecular da fluorescência (BiFC)

A complementação bimolecular da fluorescência (BiFC) é uma técnica recente usada na investigação e no visualização directo de interacções da proteína-proteína (PPIs) e interacção entre as proteínas e as outras macromoléculas que são essenciais para a sobrevivência das pilhas. A identificação destas relações especifica seu trabalho dentro das pilhas em breve. Os organismos com redes de PPI incluem seres humanos, sem-fins, fermento, e plantas.

Crédito: Carl Du Pont/Shutterstock.com

BiFC é usado principalmente em estudos genoma-largos de PPIs; é identificado como uma técnica eficaz em descobrir interacções novas da proteína, e em fornecer a informação nova em funções da proteína.

Princípio de BiFC

O princípio de funcionamento de BiFC é baseado na revelação de um complexo fluorescente, em conseqüência da associação de dois segmentos de uma proteína fluorescente quando estão na grande proximidade devido à interacção da proteína-proteína nos fragmentos, isto é, em BiFC, um fluoróforo é dividido em amino e extremidades terminais carboxyl. Estas extremidades são combinadas em duas proteínas. Quando estas duas proteínas interagem, ambos os segmentos reassociam tendo por resultado a re-formação do fluoróforo e da fluorescência nos locais da relação.

Grupo de regras para projectar BiFC

As experiências de BiFC - enquanto é baseado na interacção entre os segmentos fluorescentes da proteína - ocorrem somente em certas circunstâncias. A análise de BiFC envolve um ensaio que seja fabricado de tal maneira que satisfaz todos os parâmetros que afetam a associação dos segmentos fluorescentes da proteína. O procedimento da fabricação do ensaio inclui:

Calibração de BiFC

A calibração de BiFC é realizada em quatro fases como segue:

  1. A selecção de fluoróforo apropriado que trabalha finamente como a síntese de BiFC partners. Os exemplos dos fluorophores são Vênus e proteína fluorescente amarela (YFP).
  2. A rotulagem das proteínas em que o BiFC segmenta é ligada ao amino ou aos carboxyl-terminais da proteína selecionada.
  3. Determinação de circunstâncias do transfection antes do teste de mutantes múltiplos.
  4. A determinação das mudanças que ocorrem na localização das proteínas devido à adição de BiFC segmenta.

Transfection do chapeamento e da pilha

Neste processo, as pilhas são chapeadas inicialmente em uma placa inferior de vidro e em dois poços de uma placa de 6 poços e são permitidas então estabelecer-se durante a noite na temperatura ambiente. A pilha DNAs é preparada então para o processo do transfection. Após conclusão do processo do transfection, a combinação é dividida ingualmente e incubada então na temperatura ambiente por algumas horas. Então os media do transfection são removidos e incubados mais uma vez na condição da sala.

Preparação das pilhas para a imagem lactente

Neste processo, as pilhas são analisadas inicialmente usando um microscópio epifluorescent a fim verificar sua fluorescência. Então, a preparação das pilhas é feita pela adição de paraformaldehyde depois do qual as pilhas lysed para obter a imagem.

Imagem lactente das pilhas

A intensidade da fluorescência é determinada para cada única pilha. A análise selectiva de sinais de BiFC é conseguida executando o transfection junto com o CFP. A imagem lactente é feita usando um microscópio confocal.

Quantificação da fluorescência

A medida da intensidade da fluorescência é utilização realizada diversa software da imagem lactente.

Análise dos dados

As eficiências da complementação da fluorescência são determinadas pelo valor obtido pela divisão das intensidades da complementação da fluorescência e das intensidades da proteína fluorescente inteira em cada pilha.

Projecto da experiência multicolorido de BiFC

A experiência multicolorido de BiFC envolve a combinação de sócios substitutional e dos segmentos das proteínas fluorescentes que rendem compostos com as faixas diferentes da cor. A imagem lactente seqüencial é conseguida pelo visualização dos compostos que envolvem comprimentos de onda distintos da emissão e da excitação. A imagem lactente dos compostos é feita alternativamente para impedir a re-localização de um ou outro composto baseado na retardação entre a imagem lactente dos compostos.

As intensidades da fluorescência devem ser mantidas no valor constante a fim impedir a revelação da variação nas distribuições causadas pela variação na relação do sinal-à-fundo. Os distúrbios entre dois fluorophores podem igualmente ser rectificados pela imagem lactente as pilhas que representam somente um grupo de proteínas.  

BiFC multicolorido foi estabelecido primeiramente em pilhas mamíferas nos estudos que várias combinações usadas de YFP e de CFP. BiFC maquina para examinar as eficiências relativas da interacção dos bFos com bJun e bATF2.

A melhoria de um método multicolorido de BiFC para pilhas da planta ajuda na investigação da revelação simultânea de complexos alternativos da quinase do sensor/proteína do cálcio no planta.

Aplicações do ensaio de BiFC

As aplicações de BiFC incluem a imagem lactente da distribuição de estado estacionário dos compostos desenvolvidos agrupando das proteínas em vários tipos de pilhas e de organismos. Igualmente permite a imagem lactente das interacções entre proteínas múltiplas em uma única pilha além do que alterações nas proteínas covalent que fornecem a informações adicionais sobre os processos biológicos de compostos da proteína que são encontrados recentemente.

É igualmente útil na identificação dos vários segmentos da proteína que podem ser combinados pela interacção entre as proteínas que são ligadas aos segmentos que incluem a β-galactosidase, o ubiquitin, e o reductase do dihydrofolate. As experiências de BiFC são igualmente úteis na determinação da topologia de proteínas da membrana e da inspecção alta da entrada e da saída de efeitos moleculars pequenos nos compostos da proteína.

Fontes

  1. http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2012/November/Bimolecular-fluorescence-complementation-BiFC-A-5-year-update-and-future-perspectives/biotechniques-337088.html?pageNum=1
  2. http://www.vanderbilt.edu/cbi/Presentations/EmPresentation.pdf
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2829326/
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3169261/
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2829326/
  6. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-313X.2008.03612.x/pdf
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2518326/

[Leitura adicional: BiFC]

Last Updated: Feb 26, 2019

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