Complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC)

La complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFC) es una técnica reciente usada en la investigación y la visualización directa de las acciones recíprocas de la proteína-proteína (PPIs) y acción recíproca entre las proteínas y otras macromoléculas que son esenciales para la supervivencia de células. La identificación de estas relaciones especifica su trabajo dentro de las células en resumen. Los organismos con las redes de PPI incluyen seres humanos, tornillos sin fin, la levadura, y las instalaciones.

Haber: Carl Du Pont/Shutterstock.com

BiFC se utiliza principal en estudios genoma-anchos de PPIs; se determina como técnica efectiva en la destapadura de nuevas acciones recíprocas de la proteína, y ofrecer la información nueva en funciones de la proteína.

Principio de BiFC

El principio de funcionamiento de BiFC se basa en el revelado de un complejo fluorescente, como resultado de la asociación de dos segmentos de una proteína fluorescente cuando están en la gran proximidad debido a la acción recíproca de la proteína-proteína en los fragmentos, es decir, en BiFC, un fluoróforo se divide en extremos terminales amino y carboxilos. Estos extremos se combinan en dos proteínas. Cuando obran recíprocamente estas dos proteínas, ambos los segmentos reasocian dando por resultado la reforma del fluoróforo y de la fluorescencia en los sitios del interfaz.

Equipo de reglas para diseñar BiFC

Los experimentos de BiFC - mientras que se basa en la acción recíproca entre los segmentos fluorescentes de la proteína - ocurren solamente en determinadas circunstancias. El análisis de BiFC implica un análisis se fabrique que de una manera tal que satisfaga todos los parámetros que afectan a la asociación de los segmentos fluorescentes de la proteína. El procedimiento de la fabricación del análisis incluye:

Calibración de BiFC

La calibración de BiFC se realiza en cuatro escenarios como sigue:

  1. La selección de fluoróforo apropiado que trabaje fino como síntesis de BiFC partners. Los ejemplos de fluorophores son Venus y proteína fluorescente amarilla (YFP).
  2. La etiqueta de las proteínas en las cuales el BiFC divide en segmentos se pega al amino o a las carboxilo-terminales de la proteína seleccionada.
  3. Determinación de las condiciones económicas de la transfección antes de la prueba de mutantes múltiples.
  4. La determinación de los cambios que ocurren en la localización de las proteínas debido a la adición de BiFC divide en segmentos.

Transfección del laminado y de la célula

En este proceso, las células se chapan inicialmente en una chapa fonda de cristal y en dos pozos de una placa de 6 pozos y entonces se permiten establecer durante la noche en la temperatura ambiente. Entonces la célula DNAs se prepara para el proceso de la transfección. Tras completar el proceso de la transfección, la combinación se divide igualmente y después se incuba en la temperatura ambiente por algunas horas. Después los ambientes de la transfección se quitan y se incuban de nuevo en la condición del sitio.

Preparación de las células para la proyección de imagen

En este proceso, las células se analizan inicialmente usando un microscopio epifluorescent para verificar su fluorescencia. Entonces, la preparación de células es hecha por la adición del paraformaldehido después de lo cual las células lysed para obtener la imagen.

Proyección de imagen de células

La intensidad de la fluorescencia es resuelta para cada célula. El análisis selectivo de las señales de BiFC es logrado realizando la transfección junto con el CFP. La proyección de imagen se hace usando un microscopio confocal.

Cuantificación de la fluorescencia

La medición de la intensidad de la fluorescencia es realizada usando varios software de la proyección de imagen.

Análisis de datos

Las eficiencias de la complementación de la fluorescencia son determinadas por el valor obtenido por la división de las intensidades de la complementación de la fluorescencia y de las intensidades de la proteína fluorescente entera en cada célula.

Diseño del experimento multicolor de BiFC

El experimento multicolor de BiFC implica la combinación de socios sustitutivos y de los segmentos de las proteínas fluorescentes que rinden composiciones con diversas bandas del color. La proyección de imagen secuencial es lograda por la visualización de las composiciones que implican longitudes de onda distintas de la emisión y de la excitación. La proyección de imagen de las composiciones se hace alternativamente para prevenir la re-localización de cualquier composición basada en el retraso entre la proyección de imagen de las composiciones.

Las intensidades de la fluorescencia se deben mantener en la magnitud constante para prevenir el revelado de la variación en las distribuciones causadas por la variación en la índice del señal-a-fondo. Las perturbaciones entre dos fluorophores se pueden también rectificar por la proyección de imagen las células que representan solamente un grupo de proteínas.  

BiFC multicolor primero fue establecido en células mamíferas en estudios que las diversas combinaciones usadas de YFP y del CFP. BiFC idea para examinar las eficiencias relativas de la acción recíproca de los bFos con el bJun y bATF2.

La mejoría de un método multicolor de BiFC para las células de la instalación ayuda en la investigación del revelado simultáneo de los complejos alternativos de la cinasa del sensor/de proteína del calcio en planta.

Usos del análisis de BiFC

Los usos de BiFC incluyen la proyección de imagen de la distribución de estado estacionario de las composiciones desarrolladas agrupando de proteínas en diversos tipos de células y de organismos. También habilita la proyección de imagen de acciones recíprocas entre las proteínas múltiples en una célula además de cambios en las proteínas covalentes que ofrecen la información adicional sobre los procesos biológicos de las composiciones de la proteína que se encuentran recientemente.

Es también útil en la identificación de los diversos segmentos de la proteína que se pueden combinar por la acción recíproca entre las proteínas que se pegan a los segmentos que incluyen la β-galactosidasa, el ubiquitin, y la reductasa del dihydrofolate. Los experimentos de BiFC son también útiles en la determinación de la topología de las proteínas de la membrana y de la alta inspección de entrada y del rendimiento de pequeños efectos moleculares sobre las composiciones de la proteína.

Fuentes

  1. http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2012/November/Bimolecular-fluorescence-complementation-BiFC-A-5-year-update-and-future-perspectives/biotechniques-337088.html?pageNum=1
  2. http://www.vanderbilt.edu/cbi/Presentations/EmPresentation.pdf
  3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2829326/
  4. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3169261/
  5. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2829326/
  6. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-313X.2008.03612.x/pdf
  7. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2518326/

[Lectura adicional: BiFC]

Last Updated: Feb 26, 2019

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