Reporter del prodotto chimico di Bioorthogonal

I reporter chimici di Bioorthogonal sono piccoli reporter esogeni che chimicamente non modificano le biomolecole che siano etichettati a. I loro mezzi di piccola dimensione non interferiscono con espressione genica o la funzione della proteina e possono quindi fornire i risultati più affidabili negli studi della ricerca.

Credito di immagine: bogdanhoda/Shutterstock

Uno dei modi capire i trattamenti cellulari è di tenere la carreggiata le molecole differenti facendo uso dei reporter. Etichettando una proteina con la proteina fluorescente verde (GFP) è uno dei modi più popolari di rintracciamento la posizione e del movimento delle proteine all'interno di una cella.

Le proteine di fusione di GFP sono molto ampiamente usate come sua sequenza del DNA possono aggiungersi all'estremità di un gene e non richiede alcuni fattori supplementari. Tuttavia, la dimensione di GFP è abbastanza grande in grado di possibilmente pregiudicare l'espressione e la funzione della proteina a cui è etichettata.

Inoltre, i tag come GFP possono applicarsi soltanto a proteina ed a non altre biomolecole quali i glycans ed i lipidi. Similmente, i coniugati dell'anticorpo sono un altro metodo per tenere la carreggiata le biomolecole dentro le celle. Di nuovo, la dimensione è un considerevole fattore qui in grado di modificare gli stessi parametri che prova a misurare.

A questo scopo, le piccole molecole per etichettare e riferire la localizzazione delle biomolecole è un campo di ricerca sempre più interessante. Le piccole molecole possono attraversare facilmente le intra e membrane intercellulari e non pregiudicano la mobilità ed i beni delle molecole che sta riferendo. Un tale approccio è uso dei reporter del prodotto chimico di bioorthogonal.

Progettazione dei reporter del prodotto chimico di bioorthogonal

Il piccolo reporter è etichettato idealmente ad un'impalcatura dell'obiettivo e non induce alcuni mutamenti strutturali. Solitamente le impalcature dell'obiettivo sono selezionate tali che sono usate dal macchinario cellulare. Per esempio, una delle impalcature dell'obiettivo è amminoacidi, che portano i gruppi chimici ortogonali. Questi amminoacidi sono impiegati dalla cella durante la traduzione di proteine.

Un altro esempio è l'uso di trasporto dei monosaccharaides (impalcatura) reporter chimici che è compreso nei glycans della superficie delle cellule dalla cella. Alcuni dei reporter chimici di bioorthogonal attuale sono discussi qui sotto.

Sequenze del peptide di Bioorthogonal

Uno dei reporter chimici di bioorthogonal è una sequenza del peptide che consiste di un motivo di tetracysteine (CCXXCC), dove XX può essere tutti gli due amminoacidi, prolina e la glicina è desiderabile.

Questo reporter di hexapeptide è fuso al gene della proteina bersaglio ed è espresso in celle. È molto più piccolo di GFP e fornisce un'alternativa fattibile senza indurre le perturbazioni strutturali nella proteina bersaglio.

Chetoni ed aldeidi

I chetoni e le aldeidi come reporter chimici possono etichettare i glycans e metaboliti come pure proteine secondari. Malgrado la possibilità delle reazioni di condensazione dell'aldeide e del chetone, questo è limitato solitamente negli organismi viventi mentre richiede un pH di 5-6, che non è possibile per la maggior parte delle celle viventi.

Sono usate il più bene sulle superfici delle cellule e sull'ambiente extracellulare, poichè i metaboliti basati sui chetoni e sulle aldeidi sono presenti all'interno della cella. Di conseguenza, il chetone e le aldeidi rientrano nella categoria di reporter chimici biorestricted `.

Azoturi

Gli azoturi sono un altro tipo di reporter chimico possibile. Sono abiotici e non assenti in tessuto vivente. Non reagiscono con acqua o non subiscono l'ossidazione o non reagiscono con le ammine e i nucleophiles.

Sebbene possano subire la riduzione, richiede il riscaldamento vigoroso (100°C). Sono molto stabili alle temperature fisiologiche e così, sono i reporter chimici possibili. Sono corrente ampiamente usate come droghe, come AZT.

Introduzione dei reporter chimici di bioorthogonal nelle biomolecole

Come chetoni, le aldeidi e gli azoturi non sono naturalmente presenti nei 20 amminoacidi naturali, l'incorporazione di questi gruppi nelle proteine comprende l'aggiunta degli amminoacidi artificiali. Per esempio, uno dei modi dell'incorporazione dell'amminoacido artificiale è di sostituire l'amminoacido naturale con il suo analogo modificato che contiene uno di questi residui.

Per più ulteriormente evitare la concorrenza con amminoacido naturale, i batteri possono essere resi auxotrofici per un amminoacido particolare prima che un analogo artificiale strettamente connesso si aggiunga. Ciò significa che i batteri sono fatti per richiedere la presenza dell'amminoacido particolare per potere svilupparsi. Di conseguenza, i batteri poi incorpora l'amminoacido artificiale nelle proteine fatte durante la crescita.

Similmente, questi gruppi chimici possono aggiungersi ai lipidi collocando questi gruppi chimici alle proteine farnesylated. Il gruppo di farnesyl è una parte del lipido del isoprenoid che è post--di traduzione aggiunta alle proteine. Quindi, i gruppi chimici ortogonali differenti possono aggiungersi ai gruppi-obiettivo se la loro via biosysthetic è tollerante dei precursori che sono stati modificati.

Reporter chimici di Bioorthogonal per studiare funzione della proteina

Oltre a usando questo reporter per studiare la localizzazione della molecola dell'obiettivo, egualmente sono stati usati per analizzare la funzione degli enzimi dove il reporter prevede l'attività catalitica piuttosto che la localizzazione.

I reporter chimici di Bioorthogonal hanno applicazioni ampie per analizzare le proteine bersaglio senza indurre le modifiche chimiche e strutturali. Devono essere chimicamente selettive (cioè non legatura non specifico), non dovrebbero degradarsi rapidamente dentro una cella e non dovrebbero accumulare le celle interne. Quindi, molto pochi reporter chimici passano questi criteri rigorosi.

Tuttavia, parecchie sfide rimangono nell'uso di questi reporter chimici, soprattutto la concorrenza fra i substrati indigeni e gli amminoacidi in modo innaturale modificati, lipidi e gli zuccheri. Eppure, possiedono parecchi vantaggi sopra le proteine fluorescenti come GFP che sono corrente ampiamente usati riferire le molecole dell'obiettivo.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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