Metodologia di CHIAREZZA

La tecnica di CHIAREZZA è una tecnica usata per rimuovere i tessuti dei lipidi e per permettere a immunolabelling di interi, organi intatti. Ciò presenta i vantaggi sopra i metodi tradizionali, che sono dipeso sempre dall'affettatura del tessuto e dalla ricostruzione ad una data ulteriore - con conseguente deformazione ed inesattezza del tessuto.

Illustrazione del cervello umano - interi cervelli sono analizzati facendo uso di CHIAREZZA - dal hakusantohakusanto | Shutterstock

Lipido-scambiato, anatomicamente rigido, la rappresentazione/immunostaining compatibile, metodo dell'idrogel del tessuto (CHIAREZZA) inizialmente è stato progettato nel 2013 da Chung e da Deisseroth alla scuola di medicina di Stanford University. Facendo uso di questo trattamento, gli organi post mortem possono essere contrassegnati per le proteine e gli acidi nucleici, permettendo all'analisi dei campioni intatti di creare le immagini dettagliate 3D.

Metodologia

Ogni fase della tecnica di CHIAREZZA è descritta qui sotto:

Fissatore del tessuto

Il primo punto in questo trattamento è di infondere il campione di tessuto con i monomeri dell'idrogel (quali l'acrilamide o il bisacrylamide) e la formaldeide. In tutto questo trattamento, la formaldeide è molto importante, poichè unisce con legami atomici incrociati il tessuto e l'associazione i monomeri dell'idrogel alle proteine ed agli acidi nucleici.

La fase seguente comprende la polimerizzazione in una maglia dell'idrogel, infine assicurante che il tessuto rimanga intatto, conservando la struttura originale dell'organo ed assicurandosi che le posizioni delle proteine e degli acidi nucleici non siano alterate.

Rimozione del lipido

I monomeri dell'idrogel utilizzati nella fase del fissatore del tessuto non legano ai lipidi e ad altre biomolecole che mancano dei gruppi funzionali specifici. Ciò è importante poichè tiene conto i lipidi essere eliminata. Ciò è raggiunta da una tecnica ionica novella dell'estrazione, in cui i tessuti sono trattati con SDS e una corrente elettrica è passata, portante i lipidi dal tessuto.

Senza la corrente, il trattamento passivo richiede intorno 2 settimane e quindi la corrente elettrica è molto importante nell'accelerazione del trattamento globale. Lo SDS ha qualità lipofiliche, significanti che lega ai lipidi e li porta dal tessuto. Ciò rende il tessuto trasparente, permettendo l'analisi al microscopio. Tuttavia, mentre le proteine e gli acidi nucleici sono fissati sul posto, non sono eliminate.

Ripristino del tessuto

In tutto questo trattamento del preparato, il tessuto ingrandice, richiedendo il ripristino con il trattamento in una soluzione di corrispondenza rifranta di indice analitico. Ritornato una volta alle dimensioni originali, il campione può poi essere usato per la rappresentazione.

Preparato di rappresentazione

Una volta che il tessuto è riparato, può poi essere usato dentro per la rappresentazione di varie biomolecole. Ciò può essere con i vari metodi, quale l'immunofluorescenza facendo uso degli anticorpi etichettati, o dai contrassegni dell'acido nucleico. Una volta che contrassegnato, le immagini possono poi essere catturate facendo uso delle tecniche standard di rappresentazione o dell'immunofluorescenza.

Analizzare i risultati

In generale, questa tecnica piombo alla generazione di alta qualità, altamente dettagliata, le immagini 3D degli organi intatti. Una volta che un'immagine è ottenuta, i primi anticorpi possono essere eliminati ed i secondi anticorpi possono essere applicati, piombo alla produzione dei risultati multipli per campione di tessuto.

Di conseguenza, questa tecnica può produrre le immagini accurate e affidabili che dimostrano la proteina e la posizione e l'interazione dell'acido nucleico, mentre fornisce ulteriori dati sulle strutture sottocellulari e le comunicazioni fra le celle strutturali differenti.

Questa tecnica si è applicata in molti campi di ricerca, quali il morbo di Alzheimer, la sclerosi a placche e la ricerca di autismo. Ancora, può anche essere utilizzata sopra una vasta gamma di organi (milza compresa, cervello, pancreas e testicolo), in altri organismi (quale Zebrafish) ed in impianti. Di conseguenza, le applicazioni future potenziali di CHIAREZZA sono senza fine e molto promettenti.

Sorgenti

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Last Updated: Jan 8, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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