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Metodología de la CLARIDAD

La técnica de la CLARIDAD es una técnica usada para autorizar tejidos de lípidos y para habilitar immunolabelling de órganos enteros, intactos. Esto tiene ventajas sobre los métodos tradicionales, que han dependido siempre de cortar el tejido y de reconstruirlo más adelante - dando por resultado la distorsión y la inexactitud del tejido.

Ejemplo del cerebro humano - cerebros enteros se analizan usando CLARIDAD - por hakusantohakusanto | Shutterstock

Lípido-haber intercambiado, anatómico rígido, proyección de imagen/el immunostaining compatible, método del hidrogel del tejido (CLARIDAD) fue diseñado inicialmente en 2013 por Chungkin y Deisseroth en la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. Usando este proceso, los órganos post mortem se pueden etiqueta para las proteínas y los ácidos nucléicos, permitiendo al análisis de muestras intactas crear las imágenes detalladas 3D.

Metodología

Cada escenario de la técnica de la CLARIDAD se contornea abajo:

Fijación del tejido

El primer paso en este proceso es infundir la muestra de tejido con los monómeros del hidrogel (tales como acrilamida o bisacrylamide) y el formaldehido. En este proceso, el formaldehido es muy importante, pues reticula el tejido y el atascamiento los monómeros del hidrogel a las proteínas y a los ácidos nucléicos.

El escenario siguiente implica la polimerización en una malla del hidrogel, asegurándose final de que permanece el tejido intacto, conservando la estructura original del órgano y asegurándose de que las posiciones de proteínas y de ácidos nucléicos no están alteradas.

Retiro del lípido

Los monómeros del hidrogel usados en el escenario de la fijación del tejido no atan a los lípidos y a otras biomoléculas que faltan a grupos funcionales específicos. Esto es importante pues permite para que los lípidos sean quitados. Esto es lograda por una técnica iónica nueva de la extracción, en la cual los tejidos se tratan con el SDS y una corriente eléctrica se ejecuta a través, llevando los lípidos fuera del tejido.

Sin la corriente, el proceso pasivo tarda alrededor 2 semanas y por lo tanto la corriente eléctrica es muy importante en la aceleración del proceso total. El SDS tiene calidades lipofílicas, significando que ata a los lípidos y los lleva fuera del tejido. Esto hace el tejido transparente, permitiendo análisis microscópico. Sin embargo, como las proteínas y los ácidos nucléicos se reparan en el lugar, no se quitan.

Restauración del tejido

En este proceso de la preparación, el tejido aumenta, requiriendo la restauración con el tratamiento en una solución de igualación refractada del índice. Vuelto una vez a las dimensiones originales, la muestra se puede entonces utilizar para la proyección de imagen.

Preparación de la proyección de imagen

Una vez que se restablece el tejido, puede entonces ser utilizado hacia adentro para la proyección de imagen de diversas biomoléculas. Esto puede estar con diversos métodos, tales como inmunofluorescencia usando los anticuerpos marcados con etiqueta, o por las escrituras de la etiqueta del ácido nucléico. Una vez que están etiqueta, las imágenes se pueden entonces capturar usando técnicas estándar de la inmunofluorescencia o de proyección de imagen.

Analizar los resultados

Total, esta técnica lleva a la generación de alta calidad, altamente detallada, imágenes 3D de órganos intactos. Una vez que se obtiene una imagen, los primeros anticuerpos pueden ser quitados, y los segundos anticuerpos pueden ser aplicados, llevando a la producción de resultados múltiples por muestra de tejido.

Por lo tanto, esta técnica puede producir las imágenes exactas, seguras que demuestran la proteína y la situación y la acción recíproca del ácido nucléico, mientras que ofrece otros datos en las estructuras subcelulares, y comunicaciones entre diversas células estructurales.

Esta técnica se ha aplicado en muchos campos de investigación, tales como enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, e investigación del autismo. Además, puede también ser utilizada sobre una amplia gama de órganos (bazo incluyendo, cerebro, páncreas, y testículo), en otros organismos (tales como Zebrafish) y en instalaciones. Por lo tanto, los usos futuros potenciales de la CLARIDAD son sin fin y muy prometedores.

Fuentes

Further Reading

Last Updated: Jan 8, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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