Interférence de CRISPR (CRISPRi) pour l'élimination de gène

CRISPR (boîtier des répétitions palindromiques régulièrement interspaced) sont des séquences trouvées dans approximativement 50% de bactéries et approximativement 90% d'archéobactéries, fournissant l'immunité adaptative contre le viral infection. Utilisant ces séquences, les scientifiques ont développé récemment une interférence appelée de la technique génétique neuve CRISPR (CRISPRi), qui permet l'élimination de la transcription génétique.

Système CRISPR/Cas9 pour éditer, régler et viser des génomes. La protéine Cas9 emploie une séquence de gRNA (ARN de guide) pour couper l
Système CRISPR/Cas9 pour éditer, régler et viser des génomes. La protéine Cas9 emploie une séquence de gRNA (ARN de guide) pour couper l'ADN à un site complémentaire. Structure moléculaire - ARN en rouge, ADN en jaune. Crédit d'image : ibreakstock/Shutterstock

Ces régions de CRISPR sont initialement situées entre les régions des nucléotides étrangers, dérivées des viraux infection précédents. Des gènes de système associés (Cas) par CRISPR sont également localisés tout près, qui codent les enzymes, les endonucléases et les hélicases. Ces enzymes sont transcrites et utilisées pour couper le bactériophage de envahissement ADN en éclats, qui sont alors enregistrés dans le génome d'hôte par Cas1 et Cas2. Ces séquences préenregistrées peuvent alors être transcrites pour former le crRNA et être employées pour trouver de futures infections en grippant aux séquences complémentaires et en leur permettant d'être fendu.

Quel est CRISPRi ?

La version la plus courante et la plus simple de ce système est le système du type II trouvé en streptocoques pyogènes, whichutilizes l'endonucléase Cas9 et deux types d'ARN. En 2013, Lei S Qi et autres a employé ce système pour amortir transitoirement des gènes par l'intermédiaire de la répression transcriptionnelle. Ils ont conçu une forme catalytiquement morte du gène Cas9 (dCas9) en introduisant des mutations ponctuelles dans le résidu catalytique de la nucléase (D10A et H840A). Ces mutations se sont assurées que l'endonucléase Cas9 transcrite ne pourrait pas couper l'ADN bicaténaire, mais permis l'à guider utilisant l'ARN.

Pour permettre aux gènes spécifiques d'être visé, le guide unique RNAs (sgRNA) de synthèse peut être manufacturé, composé de séquences d'ARN noncoding chimériques. Ces séquences de sgRNA contiennent trois régions qui sont indispensables pour le fonctionnement ; une région de base-appareillement (NT 20), un traitement de dCas9-binding, (NT 42) et une région de terminateur (NT 40). La région de appareillement de base peut être modifiée dans chaque cas pour viser un gène spécifique et pour guider le dCas9.

Cas9 peut être appliqué au grippage à un motif court d'ADN appelé le motif adjacent de protospacer (PAM) au 3' - extrémité de l'objectif ADN, bloquant l'action de la polymérase ARN, et par conséquent évitant l'allongement transcriptionnel. Ceci agit de réduire la quantité d'activité transcriptionnelle par « interférence » et ainsi réduit l'expression du gène associée. On lui a montré que cette application peut réduire l'expression du gène par le fois 1000.

Applications de CRISPRi

Cette technique génétique a beaucoup d'utilisations possibles dans la recherche. Premièrement, on lui a montré pour démanteler une grande proportion du génome humain efficacement, qui le rend précieux pour des applications à la recherche. Ceci aide en particulier en recensant des séquences génétiques impliquées dans les maladies héréditaires telles que certains types de cancer. Supplémentaire, il pourrait être très utile dans la recherche de cellule souche, induire particulièrement le pluripotency en cellules adultes.

Supplémentaire, ce système de CRISPRi a été montré pour avoir une utilisation potentielle dans le -règlement transcriptionnel par la pièce d'assemblage des activateurs de transcription, tels que VP16, de vérifier les rôles de l'expression du gène accrue dans une maladie.

Les avantages et les limitations de CRISPRi

Cette technique génétique de perturbation est très prometteuse dans les endroits tels que le bureau d'études de génome et la recherche de cellule souche.

Cependant, la technique de CRISPRi a quelques limitations. Elle peut affecter les gènes avoisinants, menant parfois aux effets inverses inattendus. Supplémentaire, elle se fonde sur l'utilisation de la PAM et, limite pour cette raison le nombre de gènes qui peuvent être visés.

L'avantage de CRISPRi est qu'il peut efficacement et particulièrement expression du gène de diminution jusqu'à de 99%. Supplémentaire, il a un avantage important par rapport à l'application de la méthode d'interférence ARN (RNAi) dans ce CRISPRi est facile modifier CRISPRi et peut être aussi bien employé dans des réglages de thérapie cellulaire d'ex vivo.

En conclusion, l'utilisation de la technique de CRISPRi aiderait grand dans le domaine de la thérapie génique de lignée germinale et en développant les médicaments séquence-visés de précision.

Last Updated: Feb 26, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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