Interferenza di CRISPR (CRISPRi) per soppressione del gene

CRISPR (cluster delle ripetizioni palindromiche regolarmente interspaced) sono sequenze trovate in circa 50% dei batteri ed in circa 90% del archaea, fornendo l'immunità adattabile contro l'infezione virale. Facendo uso di queste sequenze, gli scienziati hanno sviluppato di recente una nuova tecnica genetica chiamata interferenza di CRISPR (CRISPRi), che permette la soppressione di trascrizione genetica.

Sistema CRISPR/Cas9 per modificare, la regolamentazione e l
Sistema CRISPR/Cas9 per modificare, la regolamentazione e l'ottimizzazione dei genoma. La proteina Cas9 usa una sequenza del gRNA (RNA della guida) per tagliare il DNA ad un sito complementare. Struttura molecolare - RNA nel rosso, DNA nel giallo. Credito di immagine: ibreakstock/Shutterstock

Queste regioni di CRISPR originalmente sono situate fra le regioni di nucleotidi non Xeros, derivate dalle infezioni virali precedenti. I geni del sistema associati (Cas) CRISPR egualmente sono individuati vicino, che codificano gli enzimi, gli endonucleasi e i helicases. Questi enzimi sono trascritti ed utilizzati per tagliare il DNA d'invasione del batteriofago in frammenti, che poi sono memorizzati all'interno del genoma ospite da Cas1 e da Cas2. Queste sequenze memorizzate possono poi essere trascritte per formare il crRNA ed essere usate per individuare le infezioni future legando alle sequenze complementari e permettendoli di essere fenduto.

Che cosa è CRISPRi?

La versione più comune e più semplice di questo sistema è il tipo sistema di II trovato in Streptococco piogeno, whichutilizes l'endonucleasi Cas9 e due tipi di RNA. Nel 2013, Lei S Qi ed altri ha usato questo sistema per fare tacere transitoriamente i geni via repressione trascrizionale. Hanno progettato un modulo cataliticamente morto Cas9 del gene (dCas9) introducendo le mutazioni puntiformi all'interno del residuo catalitico della nucleasi (D10A e H840A). Queste mutazioni hanno assicurato che l'endonucleasi trascritto Cas9 non potrebbe tagliare da parte a parte il DNA a doppia elica, ma permesso da guidare facendo uso di RNA.

Per permettere che i geni specifici siano mirati a, la singola guida RNAs (sgRNA) della sintesi può essere fabbricata, composto di sequenze noncoding chimeriche del RNA. Queste sequenze dello sgRNA contengono tre regioni che sono vitali per la funzione; una regione d'accoppiamento (NT 20), una manopola di dCas9-binding, (NT 42) e una regione del terminatore (NT 40). La regione d'accoppiamento bassa può essere alterata in ogni caso per mirare ad un gene specifico e per guidare il dCas9.

Cas9 può applicarsi a legatura ad un breve motivo del DNA chiamato il motivo adiacente del protospacer (PAM) al 3' - estremità del DNA dell'obiettivo, bloccando l'atto del RNA polimerasi e quindi impedendo l'allungamento trascrizionale. Ciò agisce per diminuire la quantità di attività trascrizionale tramite “interferenza„ ed in modo da diminuisce l'espressione genica associata. È stato indicato che questa applicazione può diminuire l'espressione genica dalla volta 1000.

Applicazioni di CRISPRi

Questa tecnica genetica ha molti usi possibili nella ricerca. In primo luogo, è stato indicato per abbattere efficientemente una grande proporzione del genoma umano, che lo rende apprezzato per le applicazioni della ricerca. Ciò sta aiutando specialmente nell'identificazione delle sequenze genetiche in questione nelle malattie ereditarie quali determinati moduli di cancro. Ulteriormente, potrebbe essere molto utile all'interno della ricerca della cellula staminale, indurre particolarmente il pluripotency in celle adulte.

Ulteriormente, questo sistema di CRISPRi è stato indicato per avere un uso potenziale nel su-regolamento trascrizionale tramite il collegamento degli attivatori della trascrizione, quale VP16, studiare i ruoli di espressione genica aumentata in una malattia.

I vantaggi e le limitazioni di CRISPRi

Questa tecnica genetica della perturbazione molto sta promettendo nelle aree quali assistenza tecnica del genoma e la ricerca della cellula staminale.

Tuttavia, la tecnica di CRISPRi presenta alcune limitazioni. Può pregiudicare i geni vicini, a volte piombo agli effetti contrari inattesi. Ulteriormente, conta sull'uso del PAM e quindi, limita il numero dei geni che possono essere mirati a.

Il vantaggio di CRISPRi è che può efficientemente e specificamente espressione genica di diminuzione da fino a 99%. Ulteriormente, CRISPRi presenta un vantaggio significativo sopra l'applicazione del metodo di interferenza del RNA (RNAi) in quel CRISPRi è facile da modificare e può essere utilizzato ex vivo nelle impostazioni di terapia cellulare pure.

In conclusione, l'uso della tecnica di CRISPRi notevolmente aiuterebbe nel campo di terapia genica di germline e nello sviluppare le medicine sequenza-mirate a di precisione.

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Last Updated: Feb 26, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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