Interferencia de CRISPR (CRISPRi) para la supresión del gen

CRISPR (atado de repeticiones palindrómicas regularmente interspaced) son series encontradas en el aproximadamente 50% de bacterias y el aproximadamente 90% de archaea, ofreciendo inmunidad adaptante contra la infección viral. Usando estas series, los científicos tienen recientemente desarrollado una nueva técnica genética llamada la interferencia de CRISPR (CRISPRi), que permite la supresión de la transcripción genética.

Sistema CRISPR/Cas9 para corregir, regular y apuntar los genomas. La proteína Cas9 utiliza una serie del gRNA (ARN de la guía) para cortar la DNA en un sitio complementario. Estructura molecular - ARN en rojo, DNA en amarillo. Haber de imagen: ibreakstock/Shutterstock
Sistema CRISPR/Cas9 para corregir, regular y apuntar los genomas. La proteína Cas9 utiliza una serie del gRNA (ARN de la guía) para cortar la DNA en un sitio complementario. Estructura molecular - ARN en rojo, DNA en amarillo. Haber de imagen: ibreakstock/Shutterstock

Estas regiones de CRISPR están situadas originalmente entre las regiones de nucleótidos no nativos, derivadas de infecciones virales anteriores. Los genes asociados CRISPR (Cas) del sistema también se localizan cerca, que codifican las enzimas, los endonucleases y los helicases. Estas enzimas se transcriben y se utilizan para cortar la DNA invasora del bacteriófago en los fragmentos, que entonces son salvados dentro del genoma del ordenador principal por Cas1 y Cas2. Estas secuencias pregrabadas se pueden después transcribir para formar el crRNA y utilizar para descubrir las infecciones futuras atando a las series complementarias y permitiendo que sean hendidas.

¿Cuál es CRISPRi?

La versión más común y más simple de este sistema es el tipo sistema de II encontrado en Streptococcus pyogenes, whichutilizes el endonuclease Cas9 y dos tipos de ARN. En 2013, los leus S Qi y otros utilizaron este sistema para imponer silencio transitorio a genes vía la represión transcriptiva. Diseñaron una forma catalítico muerta del gen Cas9 (dCas9) introduciendo mutaciones de punto dentro del residuo catalítico de la nucleasa (D10A y H840A). Estas mutaciones se aseguraron de que el endonuclease transcrito Cas9 no podría cortar a través la DNA doble-trenzada, pero permitieron que fuera conducido usando el ARN.

Para permitir que los genes específicos sean apuntados, la única guía RNAs (sgRNA) de la síntesis puede ser manufacturada, integrado por series noncoding quiméricas del ARN. Estas series del sgRNA contienen tres regiones que sean vitales para la función; una región base-que empareja (NT 20), una maneta de dCas9-binding, (NT 42) y una región del adaptador (NT 40). La región que empareja baja se puede alterar en cada caso para apuntar un gen específico y para conducir el dCas9.

Cas9 se puede aplicar al lazo a un adorno corto de la DNA llamado el adorno adyacente del protospacer (PAM) en el 3' - extremo de la DNA del objetivo, cegando la acción de la polimerasa de ARN, y por lo tanto previniendo la elongación transcriptiva. Esto actúa para reducir la cantidad de actividad transcriptiva por “interferencia” y así que reduce la expresión génica asociada. Se ha mostrado que este uso puede reducir la expresión génica por el doblez 1000.

Usos de CRISPRi

Esta técnica genética tiene muchas aplicaciones posibles en la investigación. En primer lugar, se ha mostrado para golpear hacia abajo una proporción grande del genoma humano eficientemente, que hace valioso para los usos de la investigación. Esto está ayudando determinado en determinar las series genéticas implicadas en enfermedades hereditarias tales como ciertas formas del cáncer. Además, podría ser muy útil dentro de la investigación de la célula madre, inducir especialmente pluripotency en células adultas.

Además, este sistema de CRISPRi se ha mostrado para tener un uso potencial en hacia arriba-regla transcriptiva a través de la agregación de los activadores de la transcripción, tales como VP16, de investigar el papeles de la expresión génica creciente en una enfermedad.

Las ventajas y las limitaciones de CRISPRi

Esta técnica genética de la perturbación es muy prometedora en áreas tales como ingeniería del genoma e investigación de la célula madre.

Sin embargo, la técnica de CRISPRi tiene algunas limitaciones. Puede afectar a los genes próximos, llevando a veces a los efectos nocivos inesperados. Además, confía en el uso del PAM y por lo tanto, limita el número de genes que puedan ser apuntados.

La ventaja de CRISPRi es que puede eficientemente y específicamente expresión génica de la disminución por el hasta 99%. Además, CRISPRi tiene una ventaja importante sobre el uso del método de la interferencia del ARN (RNAi) en ese CRISPRi es fácil de modificarse y se puede utilizar en ex vivo fijaciones de la terapia celular también.

En conclusión, el uso de la técnica de CRISPRi ayudaría grandemente en el campo de la terapia génica del germline y en desarrollar remedio serie-apuntado de la precisión.

Fuentes:

[Lectura adicional: CRISPR]

Last Updated: Feb 26, 2019

Hannah Simmons

Written by

Hannah Simmons

Hannah is a medical and life sciences writer with a Master of Science (M.Sc.) degree from Lancaster University, UK. Before becoming a writer, Hannah's research focussed on the discovery of biomarkers for Alzheimer's and Parkinson's disease. She also worked to further elucidate the biological pathways involved in these diseases. Outside of her work, Hannah enjoys swimming, taking her dog for a walk and travelling the world.

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