CRISPR : L'extrémité pour des doigts à zinc ?

La décennie passée a porté les innovations rapides et significatives dans des techniques de génome-retouche. Pour la première fois les chercheurs ont l'opportunité de manipuler essentiellement n'importe quel gène dans une pléthore de cellules et d'organismes, utilisant les nucleases visés qui ont été conçus pour le grippement de séquence-détail de l'ADN.

Une des premières méthodes de découverte de désignation d'objectifs de gène était l'usage des nucleases appelés de doigts à zinc de protéines chimériques (ZFN) pour produire des interruptions de double-boucle. Toujours, la révolution réelle était l'introduction de CRISPR et CRISPR a associé (Cas) des systèmes dans l'arène de recherche biomédicale.

Une nucléase spécifique de CRISPR - Cas9 - appareillée avec de l'ARN court de guide a la capacité d'identifier l'objectif ADN par l'intermédiaire de l'appareillement de Watson-Torticolis. La séquence de guide trouvée dans CRISPR RNAs marque type avec des séquences de bactériophage, constituant le mécanisme pour la défense antivirale de CRISPR, qui peut facilement être substituée avec une séquence d'intérêt afin de recibler la nucléase Cas9.

Pourquoi CRISPR est-il meilleur que des doigts à zinc ?

Fonction système ZFN et CRISPR/Cas9 sur un concept assimilé : une nucléase est guidée vers une séquence spécifique dans le génome pour produire une interruption de double-boucle dans l'ADN. Une fois qu'une telle interruption est produite, les machines inhérentes de réparation de l'ADN de la cellule sont activées, et pendant le processus de réparation de l'interruption de double-boucle le génome est modifié.

La première utilisation couronnée de succès de ZFN était dans des mouches à fruit dès 2002, et depuis lors elle a été employée pour modifier le génome d'une myriade de différents organismes - comprenant ceux non considérés en tant que systèmes modèles génétiques. La spécificité obligatoire du domaine conçu de doigt à zinc indique le ZFN un site génomique spécifique.

En dépit des avantages de la retouche de génome avec ZFN, il y a plusieurs désavantages potentiels en comparaison du système CRISPR/Cas9. Par exemple, il n'y a pas droit et manière simple pour construire des domaines de doigt à zinc pour gripper une extension complète des nucléotides avec l'affinité élevée.

En outre, les modules commerciaux de ZFN sont tout à fait chers, il y a certaines difficultés pour exécuter le remontage de grands éclats (qui est pivotalement pour des coups de grâce inductibles), et la technique rend nécessaire l'examen critique afin de recenser des événements visés dans des modèles animaux.

La technologie de CRISPR/Cas offre une myriade d'avantages par rapport à ZFN, car elle se fonde sur une molécule de désignation d'objectifs unique (ARN de guide) pour la reconnaissance de séquence d'ADN. Ce fait simplifie la construction des vecteurs avec le guide multiple RNAs pour la désignation d'objectifs multiplexée de gène.

Une autre voie dont la construction des plasmides de CRISPR est simplifiée par rapport à ZFN est que des sites de reconnaissance d'ADN se composent d'acide nucléique plutôt que la protéine. Le clonage de la composante d'ADN-reconnaissance de la séquence d'ARN de guide est ainsi comparativement simple.

Il y a également une possibilité de désignation d'objectifs multiplexée par Cas9 avec l'introduction d'une suite de guide court RNAs (plutôt qu'un ensemble de protéines encombrantes). De telles modifications multiplexées (à côté de la haute performance et de la facilité de la désignation d'objectifs) ont ouvert une grande sélection d'applications en biotechnologie et médicament. La toute la qui ne signifie pas qu'il n'y a désormais aucune utilisation de ZFN, mais marée tourne vite vers la technologie de CRISPR/Cas.

Désavantages de CRISPR/Cas

Naturellement, le système CRISPR/Cas9 a également certains désavantages qui doivent être tenus compte. L'un d'entre eux est une forte incidence rapportée de clivage non spécifique d'ADN ; tandis que ceci a refroidi une partie de l'enthousiasme initial pour cette méthode, un remède potentiel est l'expression de deux modules de CRISPR avec l'activité de nickase contre deux sites génomiques qui sont attentivement à côté d'un un un autre.

Il y a alors un problème de mosaïcisme, où l'allèle de mutant est produit dans seulement certaines des cellules, car les nucleases peuvent inévitablement ne pas couper l'ADN pendant une étape de développement embryonnaire. La production des mutations multiples dans un organisme est également possible, qui peut produire les goulots d'étranglement phenotyping dans des modèles de souris.

Indépendamment de ceux la combustion des problèmes, technique de la génome-retouche CRISPR/Cas9 présente des opportunités staggering pour adresser un certain nombre de maladies hors d'atteinte des modalités thérapeutiques précédentes. Tenant compte du taux croissant de l'avancée technologique, ainsi qu'un large éventail de recherche et d'applications cliniques, la route en avant de nous sera certainement passionnante.

Sources

  1. http://www.jci.org/articles/view/72992
  2. http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
  3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4343198/
  5. http://zlab.mit.edu/assets/reprints/Cox_D_Nat_Med_2015.pdf
  6. Thakore pi, bureau d'études de génome de Gersbach CA pour des applications thérapeutiques. Dans : Laurence J, Franklin M, éditeurs. Traduction de la thérapie génique à la clinique : Techniques et approches. Édition académique, Elsevier, 2015 ; Pp. 27-44.

[Davantage de relevé : CRISPR]

Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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