CRISPR: L'estremità per i dito di zinca?

La decade passata ha portato le innovazioni rapide e significative nelle tecniche genoma-modificare. Per la prima volta i ricercatori hanno l'opportunità di manipolare essenzialmente tutto il gene in una pletora di celle e di organismi, facendo uso dei nucleases mirati a che sono stati progettati per il legame sequenza-specifico del DNA.

Uno dei primi metodi dell'innovazione di individuazione dei geni era l'uso delle proteine chimeriche chiamate nucleases dei dito di zinca (ZFN) per creare le rotture del doppio filo. Eppure, la rivoluzione reale era l'introduzione di CRISPR e CRISPR ha associato (Cas) i sistemi nell'arena biomedica della ricerca.

Una nucleasi specifica di CRISPR - Cas9 - accoppiata con il breve RNA della guida ha la capacità di riconoscere il DNA dell'obiettivo via l'accoppiamento del Watson-Torcicollo. La sequenza della guida trovata all'interno di CRISPR RNAs correla tipicamente alle sequenze del batteriofago, costituenti il meccanismo per la difesa antivirale di CRISPR, che può essere sostituita facilmente con una sequenza di interesse per ridesignare come bersaglio la nucleasi Cas9.

Perché è CRISPR migliore dei dito di zinca?

Funzione di sistemi ZFN e CRISPR/Cas9 su un simile concetto: una nucleasi è diretta verso una sequenza specifica nel genoma per creare un doppio filo irrompe il DNA. Una volta che una tal rottura è generata, il macchinario inerente della riparazione del DNA della cella è attivato e durante il processo di riparazione della rottura del doppio filo il genoma è modificato.

La prima riuscita utilizzazione di ZFN era nelle mosche di frutta già del 2002 e da allora è stata usata per alterare il genoma di una miriade degli organismi differenti - compreso quelle non considerate come sistemi-modello genetici. La specificità obbligatoria del dominio progettato del dito di zinco indica lo ZFN un sito genomica specifico.

Malgrado i vantaggi del genoma che modificano con ZFN, ci sono parecchi svantaggi potenziali in confronto al sistema CRISPR/Cas9. Per esempio, c'è non diretto e modo semplice per costruire i domini del dito di zinco per legare un allungamento completo dei nucleotidi con alta affinità.

Ancora, i moduli commerciali di ZFN sono abbastanza costosi, ci sono determinate difficoltà per eseguire la sostituzione di grandi frammenti (che è chiave per le espulsioni viscoelastiche) e la tecnica necessita la selezione per identificare gli eventi mirati a nei modelli animali.

La tecnologia di CRISPR/Cas offre una miriade dei vantaggi sopra ZFN, poichè conta su una singola molecola d'ottimizzazione (RNA della guida) per il riconoscimento di sequenza del DNA. Questo fatto semplifica la costruzione dei vettori con la guida multipla RNAs per l'individuazione dei geni multiplexata.

Un altro modo in cui la costruzione dei plasmidi di CRISPR è semplificata rispetto a ZFN è che i siti di riconoscimento del DNA sono composti di acido nucleico piuttosto che la proteina. La clonazione della componente del DNA-riconoscimento della sequenza del RNA della guida è così comparativamente semplice.

C'è egualmente una possibilità di ottimizzazione multiplexata da Cas9 con l'introduzione di una serie di breve guida RNAs (piuttosto che un insieme delle proteine ingombranti). Tali modifiche multiplexate (accanto ad alta efficienza ed alla facilità di ottimizzazione) hanno aperto una grande selezione delle applicazioni nella biotecnologia e nella medicina. Tutta la che non significa che non ci sarà uso di ZFN più, ma marea sta girando rapidamente verso la tecnologia di CRISPR/Cas.

Svantaggi di CRISPR/Cas

Naturalmente, il sistema CRISPR/Cas9 egualmente presenta determinati svantaggi che devono essere considerati. Uno di loro è un'alta incidenza riferita di fenditura non specifica del DNA; mentre questo ha raffreddato alcuno dell'entusiasmo iniziale circa questo metodo, un rimedio potenziale è l'espressione di due moduli di CRISPR con attività di nickase contro due siti genomica che sono molto attentamente adiacente ad uno un altro.

Poi c'è un problema del mosaicism, dove l'allele mutante è prodotto soltanto in alcune delle celle, poichè i nucleases non possono tagliare inevitabilmente il DNA durante l'una fase dello sviluppo embrionale. La produzione delle mutazioni multiple in un organismo è egualmente possibile, che può creare i gravi ostacoli phenotyping nei modelli del mouse.

Indipendentemente da quei problemi brucianti, la tecnica genoma-modificante CRISPR/Cas9 presenta le opportunità vacillante per l'indirizzo delle una serie di malattie fuori portata delle modalità precedenti del trattamento. Considerando il tasso di accelerazione di progresso tecnologico come pure una vasta gamma di applicazioni cliniche e del ricerca, la strada davanti noi certamente sarà eccitante.

Sorgenti

  1. http://www.jci.org/articles/view/72992
  2. http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
  3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4343198/
  5. http://zlab.mit.edu/assets/reprints/Cox_D_Nat_Med_2015.pdf
  6. Thakore pi, assistenza tecnica del genoma di Gersbach CA per le applicazioni terapeutiche. In: Laurence J, Franklin m., editori. Traduzione della terapia genica alla clinica: Tecniche e approcci. Edizione accademica, Elsevier, 2015; pp. 27-44.

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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