CRISPR: A extremidade para os dedos do zinco?

A década passada trouxe inovações rápidas e significativas em técnicas deedição. Pela primeira vez os pesquisadores têm a oportunidade de manipular essencialmente todo o gene em uma pletora de pilhas e de organismos, usando os nucleases visados que foram projectados para o emperramento seqüência-específico do ADN.

Um dos primeiros métodos da descoberta da escolha de objectivos do gene era o uso das proteínas quiméricoas chamadas os nucleases dos zinco-dedos (ZFN) para criar rupturas da dobro-costa. Ainda, a revolução real era a introdução de CRISPR e CRISPR associou (Cas) sistemas na arena biomedicável da pesquisa.

Uma nuclease específica de CRISPR - Cas9 - emparelhada com o RNA curto do guia tem a capacidade para reconhecer o ADN do alvo através do emparelhamento do Watson-Crick. A seqüência do guia encontrada dentro de CRISPR RNAs correlaciona tipicamente às seqüências do bacteriófago, constituindo o mecanismo para a defesa antivirosa de CRISPR, que pode facilmente ser substituída com uma seqüência do interesse a fim retarget a nuclease Cas9.

Por que é CRISPR melhor do que os dedos do zinco?

Função de sistemas ZFN e CRISPR/Cas9 em um conceito similar: uma nuclease é dirigida para uma seqüência específica no genoma para criar uma ruptura da dobro-costa no ADN. Uma vez que tal ruptura é gerada, a maquinaria inerente do reparo do ADN da pilha está activada, e durante o processo do reparo de ruptura da dobro-costa o genoma é alterado.

A primeira utilização bem sucedida de ZFN estava em moscas de fruto 2002, e tem sido usada desde então para alterar o genoma de uma miríade de organismos diferentes - incluindo aqueles não considerados como sistemas modelo genéticos. A especificidade obrigatória do domínio projetado do zinco-dedo aponta o ZFN a um local genomic específico.

Apesar das vantagens do genoma que editam com ZFN, há diversas desvantagens potenciais em comparação com o sistema CRISPR/Cas9. Por exemplo, há não directo e uma forma facil para construir domínios do dedo do zinco para ligar um estiramento detalhado dos nucleotides com afinidade alta.

Além disso, os módulos comerciais de ZFN são bastante caros, há determinadas dificuldades para executar a substituição de grandes fragmentos (que é giratória para KO inducible), e a técnica necessita a selecção a fim identificar eventos visados nos modelos animais.

A tecnologia de CRISPR/Cas oferece uma miríade das vantagens sobre ZFN, porque confia em uma única molécula de escolha de objectivos (RNA do guia) para o reconhecimento da seqüência do ADN. Este facto simplifica a construção dos vectores com guia múltiplo RNAs para a escolha de objectivos multiplexada do gene.

Uma outra maneira em que a construção de plasmídeo de CRISPR é simplificada em comparação com ZFN é que os locais de reconhecimento do ADN estão compor do ácido nucleico um pouco do que a proteína. A clonagem do componente do ADN-reconhecimento da seqüência do RNA do guia é assim comparativamente simples.

Há igualmente uma possibilidade de escolha de objectivos multiplexada por Cas9 com a introdução de uma série de guia curto RNAs (um pouco do que um grupo de proteínas volumosas). Tais alterações multiplexadas (ao lado da eficiência elevada e da facilidade da escolha de objectivos) abriram um vasto leque das aplicações na biotecnologia e na medicina. Toda a que não significa que não há nenhum uso de ZFN anymore, mas maré está girando rapidamente para a tecnologia de CRISPR/Cas.

Desvantagens de CRISPR/Cas

Naturalmente, o sistema CRISPR/Cas9 igualmente tem determinadas desvantagens que têm que ser levadas em consideração. Um delas é uma incidência alta relatada da segmentação não específica do ADN; quando isto refrigerar algum do entusiasmo inicial sobre este método, um remédio potencial é a expressão de dois módulos de CRISPR com actividade do nickase contra dois locais genomic que são pròxima junto a um outro.

Então há um problema do mosaicism, onde o alelo do mutante é produzido somente em algumas das pilhas, porque os nucleases não podem inevitàvel cortar o ADN durante uma fase da revelação embrionária. A produção de mutações múltiplas em um organismo é igualmente possível, que pode criar gargalos phenotyping em modelos do rato.

Apesar daqueles queimar problemas, técnica CRISPR/Cas9 deedição apresenta oportunidades staggering para endereçar um número de doenças além do alcance das modalidades precedentes do tratamento. Levando em consideração a taxa de aumento do progresso tecnologico, assim como uma vasta gama de pesquisa e de aplicações clínicas, a estrada antes de nós será certamente de excitação.

Fontes

  1. http://www.jci.org/articles/view/72992
  2. http://genesdev.cshlp.org/content/28/17/1859.full
  3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601/
  4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4343198/
  5. http://zlab.mit.edu/assets/reprints/Cox_D_Nat_Med_2015.pdf
  6. PI de Thakore, engenharia do genoma de Gersbach CA para aplicações terapêuticas. Em: Laurence J, Franklin M, editores. Traduzindo a terapia genética à clínica: Técnicas e aproximações. Imprensa académica, Elsevier, 2015; pp. 27-44.

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Last Updated: Aug 23, 2018

Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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