Cattura delle celle di circolazione di leucemia per analisi da citometria a flusso

I ricercatori hanno sviluppato una nuova metodologia per la caratterizzazione delle celle di circolazione di leucemia ed altre celle dell'basso abbondanza, da citometria a flusso. La tecnica permette alla quantificazione delle impronte della fluorescenza che forniscono la base di immunophenotyping - l'identificazione delle celle o dei sottoinsiemi delle cellule dalla loro cella-superficie o profilo intracellulare dell'indicatore.

La citometria a flusso integrazione-spettrale temporaneamente differita definita (TDI-SFC), il metodo combina l'alta risoluzione di citometria a flusso spettrale (SFC) con una telecamera CCD che funziona nel modo di TDI.

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Celle basse dellSebastian Kaulitzki | Shutterstock

Limitazioni di citometria a flusso di multiparameter

La citometria a flusso di Multiparameter permette che parecchie funzionalità delle cellule che comprendono la granularità, l'espressione della proteina e la dimensione, caratterizzino le celle. Ciascuna di queste funzionalità è tenuta la carreggiata per mezzo di contrassegno della fluorescenza, seguito da spettrale ordinando quindi il ` di termine multiparametric'.

L'ordinamento delle cellule di citometria a flusso di Multiparameter è raggiunto da ` che gating', separare le celle basate sullo spargimento come pure indicatori delineati contrassegnando di fluorescenza. Questa abilità d'ordinamento è dipende dal numero delle cellule, richiedente >10 alle celle del   000 di stabilire le soglie corrette come pure di impedire l'interferenza durante l'ordinamento spettrale. In assenza dei numeri sufficienti delle cellule, i risultati difficili di risoluzione spettrale ed il disturbo del `' generato dagli eventi insoliti di autofluorescence possono provocare l'errata classificazione delle cellule.

La microscopia di fluorescenza aggira l'errata classificazione mentre usa la fluorescenza morfologicamente localizzata. Tuttavia, le celle sono contate manualmente, che limita severamente la capacità di lavorazione clinica per i campioni che superano complessivamente 100 celle. Sebbene i cytometers di flusso della rappresentazione (IFCs) risolvano questo problema che sono costosi e l'analisi di dati è semiautomatica, ancora limitando il trattamento clinico.

Introducendo citometria a flusso integrazione-spettrale temporaneamente differita (TDI-SFC)

Una soluzione a questo problema unico è stata presentata da Hu ed altri viene sotto forma di SFC; questa versione di citometria a flusso permette all'analisi di 100-10 celle/campione del   000. Congiuntamente a TDI, la proporzione di tempo durante cui il sistema funziona (duty cycle) e la sensibilità entrambe sono migliorate.

Fotoni dell'emissione del convertito delle telecamere CCD nelle spese della foto che comprendono una schiera i pixel. In TDI, i photocharges sono spostati verso il basso da un pixel ad un altro, nel sincrono con la direzione e la velocità della cella nel flusso, permettendo il segnale del photocharge diffondersi molti pixel.

Questo effetto è analogo a panoramica della macchina fotografica ed impedisce il mosso di immagine e si riferisce a come integrazione del segnale. L'uso delle perle fluorescenti ottimizza la sincronizzazione di TDI con velocità delle cellule; globale questo fornisce tre vantaggi distinti

  1. Il rapporto segnale-rumore è migliorato da un fattore di N quando il segnale è integrato sopra le righe di N confrontate alle letture standard del interamente fotogramma.
  2. Quando le celle escono il giacimento della telecamera CCD, lo spettro di emissione integrato è inviato per la lettura; in questo modo l'otturatore non è mai chiuso. Ciò è particolarmente problematica quando il conteggio disponibile totale delle cellule è limitato dal numero nel campione (<10   000) come le celle possono sfuggire alla rilevazione del CCD.
  3. Le celle multiple possono essere risolte.

Sfruttamento della potenza di TDI-SFC

TDI-SFC può semplice e combinare parecchi segnali in che cosa si riferisce a poichè la multiplazione del `' e prestano bene il suo auto alla campionatura clinica di in grande quantità, celle dell'basso abbondanza quali le celle di circolazione di leucemia e le celle di circolazione del tumore. I ricercatori hanno presentato la cella di circolazione di leucemia che immunotyping come applicazione del proof of concept.

La cella di circolazione di leucemia che immunotyping è particolarmente pertinente nei casi dei pazienti nella remissione - le celle di circolazione di leucemia possono sviluppare la farmacoresistenza, che può evolversi nei livelli letali di malattia residua misurabile.

La microscopia di fluorescenza tradizionale e l'analisi cytometry basata di flusso di multiparameter precedentemente non è riuscito a riuscire dovuto (i) rumore di fondo che provengono dai globuli e (ii) l'abbondanza bassa di celle di circolazione di leucemia. TDI-MFC può includere un flusso-visore inclinato per diapositive per raccogliere le celle di circolazione immunonotyped di leucemia che impedisce la laser-dissezione o il raccolto unicellulare per il ripristino di circolazione delle cellule di leucemia necessario quando li ordina via la microscopia.

Hu et al. ha dimostrato l'utilità di TD-SFC per una linea cellulare della PALLA macchiata con una tintura nucleare e un indicatore leucemico (anti--TdT-FITC). 100% delle celle è stato classificato esattamente dagli spettri leggenti con gli alti segnali. Il rapporto segnale-rumore generato da TDI da solo deconvoluted da SFC con conseguente identificazione anche ai numeri bassi delle cellule (46-111 celle). La sensibilità della fluorescenza è stata migliorata entro l'intensità di eccitazione, l'apertura diaframma numerica dell'epi-illuminazione ed il tempo di integrazione.

Una chiave negli impianti?

Gli autori notano alcune limitazioni con questo TDI-sistema, tuttavia. La capacità di lavorazione è limitata dalla tariffa della lettura del CCD e dal coefficiente di variazione che misura la precisione e la ripetibilità significativamente più su (27,8%) che quello raggiunto da citometria a flusso di multiparameter (6,1%).

Gli autori speculano che l'uso del 2D piuttosto che la messa a fuoco microfluidic 1D permetterà che le celle riproducibile siano messe a fuoco per allineare le celle lateralmente e successivamente più in basso il coefficiente di variazione.

Gli autori sperano che seguendo ulteriore ottimizzazione di TDI-SFC, potrebbe potenzialmente essere ` usato in tutta l'applicazione che richiede immunophenotyping delle celle dell'basso abbondanza, come in video della malattia residua misurabile nelle leucemie acute dopo arricchimento in affinità delle celle di circolazione di leucemia da sangue periferico'.    

Sorgente:

2019) flussi Integrazione-Spettrali temporaneamente differiti Cytometer (TDI-SFC) di Hu et al. (per la Basso Abbondanza Cella Immunophenotyping. Chimica analitica. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00021

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Last Updated: Jul 26, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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