Capturando pilhas de circulação da leucemia para a análise pelo Cytometry de fluxo

Os pesquisadores desenvolveram uma metodologia nova para a caracterização de pilhas de circulação da leucemia, e outras pilhas da baixo-abundância, pelo cytometry de fluxo. A técnica permite a quantificação das assinaturas da fluorescência que fornecem a base de immunophenotyping - a identificação das pilhas ou dos subconjuntos da pilha por seu pilha-superfície ou perfil intracelular do marcador.

Termed tempo-atrasou o cytometry de fluxo integração-espectral (TDI-SFC), as ligas do método a alta resolução do cytometry de fluxo espectral (SFC) com uma câmera do CCD que opera-se no modo de TDI.

Este artigo cobrirá:

Baixas pilhas da abundância no córrego do sangueSebastian Kaulitzki | Shutterstock

Limitações do cytometry de fluxo do multiparâmetro

O cytometry de fluxo do multiparâmetro permite que diversas características da pilha que incluem a granulosidade, a expressão da proteína e o tamanho, caracterizem pilhas. Cada um destas características é seguida por meio da rotulagem da fluorescência, seguida por espectral classificando daqui o ` do termo multiparametric'.

A classificação da pilha do cytometry de fluxo do multiparâmetro é conseguida pelo ` que bloqueia', separar as pilhas baseadas no scatter assim como os marcadores traçados pela rotulagem da fluorescência. Esta capacidade de classificação é contingente no número da pilha, exigindo >10 pilhas do   000 estabelecer os pontos iniciais correctos assim como impedir a interferência durante a classificação espectral. Na ausência dos suficientes números da pilha, os resultados deficientes da definição espectral e o ruído do `' gerado dos eventos incomuns do autofluorescence podem conduzir ao erro de classificação da pilha.

A microscopia de fluorescência contorna o erro de classificação enquanto usa a fluorescência morfològica localizada. Contudo, as pilhas são contadas manualmente, que limita severamente a produção clínica para as amostras que excedem um total de 100 pilhas. Embora os cytometers do fluxo da imagem lactente (IFCs) resolvam este problema que são caros e a análise de dados é semiautomática, ainda limitando o processamento clínico.

Introduzindo o cytometry de fluxo integração-espectral tempo-atrasado (TDI-SFC)

Uma solução a este problema original foi apresentada por Hu e outros vem sob a forma de SFC; esta versão do cytometry de fluxo permite a análise de 100-10 pilhas do   000/amostra. Em combinação com TDI, a proporção de tempo durante que o sistema se opera (ciclo de dever) e a sensibilidade ambos são melhoradas.

Fotão da emissão do converso das câmeras do CCD nas cargas da foto que compreendem uma disposição dos pixéis. Em TDI, os photocharges são deslocados para baixo de um pixel a outro, no synchrony com o sentido e a velocidade da pilha no fluxo, permitindo o sinal do photocharge espalhar sobre muitos pixéis.

Este efeito é análogo à filtração da câmera e impede o borrão da imagem e é referido como a integração do sinal. O uso de grânulos fluorescentes aperfeiçoa a sincronização de TDI com velocidade da pilha; total isto fornece três vantagens distintas

  1. A relação de relação sinal-ruído está melhorada por um factor de N quando o sinal é integrado sobre as fileiras de N comparadas aos readouts padrão do completo-quadro.
  2. Quando as pilhas retiram o campo da câmera do CCD, o espectro de emissão integrado está enviado para o readout; desta maneira o obturador é nunca fechado. Isto é particularmente problemático quando a contagem de pilha disponível total é limitada pelo número na amostra (<10   000) como as pilhas podem escapar a detecção do CCD.
  3. As pilhas múltiplas podem ser resolved.

Aproveitando a potência de TDI-SFC

TDI-SFC pode simples e combinar diversos sinais no o que está referido enquanto a multiplexação do `' e emprestam seu auto bem à amostra clínica do volume alto, pilhas da baixo-abundância tais como pilhas de circulação da leucemia e pilhas de circulação do tumor. Os pesquisadores apresentaram a pilha de circulação da leucemia que immunotyping como uma aplicação do prova--conceito.

A pilha de circulação da leucemia que immunotyping é especialmente relevante nos exemplos dos pacientes na remissão - as pilhas de circulação da leucemia podem desenvolver a resistência de droga, que pode evoluir em níveis letais de doença residual mensurável.

A microscopia de fluorescência tradicional e a análise cytometry-baseada fluxo do multiparâmetro previamente não sucederam devido (i) ao ruído de fundo que originam dos glóbulos e (ii) à baixa abundância de pilhas de circulação da leucemia. TDI-MFC pode incluir um fluxo-classificador para recolher pilhas de circulação immunonotyped da leucemia que impeça a colheita da laser-dissecção ou da único-pilha para a recuperação de circulação da pilha da leucemia necessária ao as classificar através da microscopia.

Hu demonstrou e outros o serviço público de TD-SFC para uma linha celular da BOLA manchada com uma tintura nuclear e um marcador leucêmico (anti-TdT-FITC). 100% das pilhas foram classificadas exactamente por espectros de leitura com sinais altos. A relação de relação sinal-ruído gerada por TDI apenas deconvoluted por SFC tendo por resultado a identificação mesmo em baixos números da pilha (46-111 pilhas). A sensibilidade da fluorescência foi melhorada na intensidade da excitação, a abertura numérica da epi-iluminação, e o tempo de integração.

Uma chave inglesa nos trabalhos?

Os autores notam algumas limitações com este TDI-sistema, contudo. A produção é limitada pela taxa do readout do CCD e pelo coeficiente de variação que mede a precisão e a repetibilidade significativamente mais altamente (27,8%) do que aquele conseguida pelo cytometry de fluxo do multiparâmetro (6,1%).

Os autores especulam que o uso do 2D um pouco do que a focalização 1D microfluidic permitirá que as pilhas estejam focalizadas reprodutìvel para alinhar lateralmente e subseqüentemente as pilhas mais baixo o coeficiente de variação.

Os autores esperam que seguindo uma optimização mais adicional de TDI-SFC, poderia potencial ser ` usado em toda a aplicação que exige immunophenotyping de pilhas da baixo-abundância, como em monitorar a doença residual mensurável em leucemia agudas depois do enriquecimento da afinidade de pilhas de circulação da leucemia do sangue periférico'.    

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Last Updated: Jul 26, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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