Captura de las células de circulación de la leucemia para el análisis por Cytometry de flujo

Los investigadores han desarrollado una nueva metodología para la caracterización de las células de circulación de la leucemia, y otras células de la inferior-abundancia, por cytometry de flujo. La técnica habilita la cuantificación de las firmas de la fluorescencia que ofrecen la base de immunophenotyping - la identificación de células o de subconjuntos de la célula por su célula-superficie o perfil intracelular del marcador.

El cytometry de flujo integración-espectral temporizado llamado (TDI-SFC), el método combina la alta resolución del cytometry de flujo espectral (SFC) con una cámara CCD que opera en manera de TDI.

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Células inferiores de la abundancia en la corriente de la sangreSebastian Kaulitzki | Shutterstock

Limitaciones del cytometry de flujo del multiparámetro

El cytometry de flujo del multiparámetro permite que varias características de la célula que incluyen granulosidad, la expresión de la proteína y la talla, caractericen las células. Cada uno de estas características se rastrea mediante la etiqueta de la fluorescencia, seguida por espectral clasificación por lo tanto el ` del término multiparametric'.

La clasificación de la célula del cytometry de flujo del multiparámetro es lograda por el ` que bloquea', separación de las células basadas en la dispersión así como los marcadores delineados etiqueta de la fluorescencia. Esta capacidad de clasificación es eventual en el número de la célula, requiriendo >10 las células del   000 establecer los umbrales correctos así como prevenir diafonía durante la clasificación espectral. En ausencia de suficientes números de la célula, los resultados pobres de la resolución espectral y el ruido del `' generado de acciones inusuales del autofluorescence pueden dar lugar a la clasificación errónea de la célula.

La microscopia de fluorescencia evita la clasificación errónea mientras que utiliza fluorescencia morfológicamente localizada. Sin embargo, las células se cuentan manualmente, que limita seriamente la producción clínica para las muestras que exceden un total de 100 células. Aunque los cytometers del flujo de la proyección de imagen (IFCs) resuelvan este problema que son costosos y el análisis de datos es semiautomático, todavía limitando el tramitación clínico.

Introduciendo el cytometry de flujo integración-espectral temporizado (TDI-SFC)

Una solución a este problema único ha sido presentada por Hu y otros viene bajo la forma de SFC; esta versión del cytometry de flujo habilita el análisis de 100-10 células/muestra del   000. Conjuntamente con TDI, la proporción de tiempo durante la cual el sistema opera (ciclo de trabajo) y la sensibilidad ambas se perfeccionan.

Fotones de la emisión del convertido de las cámaras CCD en las cargas de la foto que comprenden un arsenal de pixeles. En TDI, los photocharges cambio hacia abajo a partir de un pixel a otro, en synchrony con la dirección y la velocidad de la célula en el flujo, permitiendo la señal del photocharge de extender por muchos pixeles.

Este efecto es análogo al encuadramiento de la cámara y previene la niebla de la imagen y se refiere como integración de la señal. El uso de molduras fluorescentes optimiza la sincronización de TDI con velocidad de la célula; total esto ofrece tres ventajas distintas

  1. El ratio señal/ruido es perfeccionado por un factor de N cuando la señal es integrada sobre las filas de N comparadas a las lecturas estándar del completo-marco.
  2. Cuando las células salen el campo de la cámara CCD, el espectro de emisión integrado se envía para la lectura; de esta manera el obturador nunca es cerrado. Esto es determinado problemático cuando el recuento celular disponible total es limitado por el número en la muestra (<10   000) como las células pueden escape la detección del CCD.
  3. Las células múltiples pueden ser resueltas.

Aprovechamiento de la potencia de TDI-SFC

TDI-SFC puede simple y combinar varias señales en se refiere qué como la multiplexación del `' y él presta a su uno mismo bien al muestreo clínico de en grandes cantidades, las células de la inferior-abundancia tales como células de circulación de la leucemia y células de circulación del tumor. Los investigadores presentaron la célula de circulación de la leucemia immunotyping como uso del prueba-de-concepto.

La célula de circulación de la leucemia immunotyping es especialmente relevante en casos de pacientes en la remisión - las células de circulación de la leucemia pueden desarrollar la resistencia a los medicamentos, que puede desarrollarse en niveles mortíferos de enfermedad residual mensurable.

La microscopia de fluorescencia tradicional y el análisis cytometry-basado flujo del multiparámetro no ha podido previamente tener éxito debido (i) al ruido de fondo que originaba de los glóbulos y (ii) a la abundancia inferior de células de circulación de la leucemia. TDI-MFC puede incluir a un flujo-compaginador para cerco las células de circulación immunonotyped de la leucemia que prevenga la laser-disección o la cosecha unicelular para la recuperación de circulación de la célula de la leucemia necesaria al clasificación las vía microscopia.

Hu y otros demostró la utilidad de TD-SFC para una variedad de células de la BOLA manchada con un tinte nuclear y un marcador leucémico (antis-TdT-FITC). 100% de células fue clasificado exacto por espectros de lectura con las altas señales. El ratio señal/ruido generado por TDI solamente deconvoluted por SFC dando por resultado la identificación incluso en los números inferiores de la célula (46-111 células). La sensibilidad de la fluorescencia fue perfeccionada por la intensidad de la excitación, la apertura numérica de la epi-iluminación, y el tiempo de integración.

¿Una llave de tuercas en los trabajos?

Los autores observan algunas limitaciones con este TDI-sistema, sin embargo. La producción es limitada por el índice de la lectura del CCD y el coeficiente de variación que mida la precisión y la repetibilidad importante más arriba (27,8%) que lo lograda por el cytometry de flujo del multiparámetro (6,1%).

Los autores especulan que el uso del 2.o bastante que el enfoque microfluidic 1D permitirá que las células reproductivo sean enfocadas para alinear las células lateralmente y posteriormente más bajo el coeficiente de variación.

Los autores esperan que siguiendo la optimización adicional de TDI-SFC, podría potencialmente ser ` usado en cualquier uso que requería immunophenotyping de las células de la inferior-abundancia, por ejemplo en vigilar enfermedad residual mensurable en leucemias agudas después del enriquecimiento de la afinidad de las células de circulación de la leucemia de la sangre periférica'.    

Fuente:

2019) flujos Integración-Espectrales temporizados Cytometer (TDI-SFC) de Hu y otros (para la Inferior-Abundancia-Célula Immunophenotyping. Química analítica. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.9b00021

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Last Updated: Jul 26, 2019

Hidaya Aliouche

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Hidaya Aliouche

Hidaya is a science communications enthusiast who has recently graduated and is embarking on a career in the science and medical copywriting. She has a B.Sc. in Biochemistry from The University of Manchester. She is passionate about writing and is particularly interested in microbiology, immunology, and biochemistry.

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