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Ensaios do metabolismo da pilha

O metabolismo da pilha é essencial para a fisiologia normal em todos os organismos. Muitos ensaios diferentes são usados para detectar e medir o metabolismo celular, segundo o metabolito que está sendo investigado.

Crédito de imagem: Vshivkova/Shutterstock

Detecção da glicose

(2 (n (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino) - 2-Deoxyglucose) ensaio 2-NBDG

Medir a tomada da glicose dentro das pilhas é importante avaliar diversos processos biológicos e seus estados da doença. Por exemplo, a tomada de medição da glicose durante o diabetes é crítica. 2-NBDG é uma proteína fluorescente e um analogue da glicose.

Neste ensaio, 2-NBDG é incubado directamente com as pilhas. Após alguma hora, a intensidade da fluorescência dentro das pilhas é medida usando o cytometry de fluxo. Este ensaio é usado igualmente para medir as mudanças na tomada da glicose na presença das drogas anti-diabéticas diferentes.

Ensaio da oxidase de glicose

10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine é uma carcaça da peroxidase. Enquanto as reacções da oxidase e da peroxidase de glicose são acopladas, este ensaio pode ser usado para medir a actividade da glicose e os níveis da glicose dentro das pilhas, do alimento, e dos líquidos corporais.

Neste ensaio, a oxidase de glicose reage com a glicose para gerar a água oxigenada. A água oxigenada reage então com um reagente (vermelho de Ampex) para gerar uma proteína fluorescente vermelha chamada resorufin. Os níveis desta proteína fluorescente vermelha podem então ser usados para analisar os níveis de glicose.

Colesterol

Ensaio do hidrogênio-peróxido do colesterol

O colesterol existe dentro das pilhas como o colesterol e ésteres livres do colesterol. Este ensaio usa um composto que reaja com HO22 produzido pela oxidação do colesterol e produza um composto fluorescente.

Este ensaio pode medir o colesterol livre e os ésteres do colesterol e é altamente sensível; podendo detectar mesmo quantidades muito pequenas do colesterol (200 nanômetro). Tem o autoflourescence mínimo e a fluorescência pode ser medida em pontos múltiplos do tempo.

Ensaio Phosphatidylcholine-Específico do Phospholipase C (PC-PLC)

Neste ensaio, 10 acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine são usados como uma ponta de prova. PC-PLC pode converter o phosphatidylcholine ao phosphocholine e ao diacylglycerol.

A fosfatase alcalina converte então o phophorylcholine ao choline que é oxidado então para formar a água oxigenada. Esta água oxigenada pode então reagir com os 10 acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine para formar uma proteína fluorescente vermelha chamada resorufin.

O sinal fluorescente pode ser detectado usar o microcopy para analisar a actividade do phospholipase-c. O ensaio de PC-PLC é um ensaio sensível com autoflourescence mínimo.

Detecção do ATP

Este ensaio usa o luciferase de recombinação do vaga-lume e a sua carcaça (D-luciferin) para determinar os níveis do ATP dentro das pilhas. Luciferase produz a luz na presença do ATP. Este ensaio é muito sensível e pode detectar 0,1 picomole de ATP pre-existente ou do ATP recentemente formado.

Este ensaio pode ser usado para detectar mudanças do ATP durante reacções enzimáticos diferentes e a contaminação bacteriana no sangue, no leite, na urina, e no solo. Pode igualmente ser usado para analisar a proliferação de pilha, a citotoxidade, os efeitos dos antibióticos e drogas anticancerosas.

ensaio da oxidase da Galactose-galactose

Este ensaio é usado para detectar os níveis de galactose dentro das pilhas. Neste ensaio, a oxidase da galactose é usada para catalisar a galactose para gerar a água oxigenada.

A água oxigenada reage então com o composto vermelho de Ampex para gerar uma proteína fluorescente vermelha chamada resorufin. A fluorescência do resorufin é medida e usada como um indicador dos níveis de galactose na amostra.

E também o metabolismo da pilha, o ensaio da oxidase da galactose-galactose pode ser usado para estudar a sinalização da pilha, neurobiologia, inflamações, função imune. A fluorescência gerada pelo resorufin é estável pelo menos a 3 horas.

Ensaio da água oxigenada

O ensaio da água oxigenada do laço é um método sensível para detectar os níveis de água oxigenada dentro das pilhas. Este ensaio usa um vermelho de Ampex do reagente que reaja com a água oxigenada para gerar uma proteína fluorescente vermelha chamada resorufin.

Os níveis de resorufin podem ser usados como um indicador para medir HO22 os níveis. Este é um ensaio muito sensível de que possa medir mesmo 10 picomoles HO22.

Fontes:

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Last Updated: Feb 26, 2019

Dr. Surat P

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Dr. Surat P

Dr. Surat graduated with a Ph.D. in Cell Biology and Mechanobiology from the Tata Institute of Fundamental Research (Mumbai, India) in 2016. Prior to her Ph.D., Surat studied for a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Zoology, during which she was the recipient of an Indian Academy of Sciences Summer Fellowship to study the proteins involved in AIDs. She produces feature articles on a wide range of topics, such as medical ethics, data manipulation, pseudoscience and superstition, education, and human evolution. She is passionate about science communication and writes articles covering all areas of the life sciences.  

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