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Préparation de cellules pour la cytométrie de flux

La cytométrie de flux est une technique populaire employée pour mesurer l'expression des molécules, pour recenser des cellules, et pour analyser la taille et le volume de cellules. Elle concerne le plus couramment marquer des cellules des anticorps fluorescents ou des ligands, qui grippent des objectifs spécifiques dans la cellule à trouver.

Par HakatCrédit d'image : Hakat/Shutterstock

Types d'échantillons

Les échantillons les plus simples à se préparer à la cytométrie de flux sont les cellules de culture suspendues, les micros-organismes portés par les eaux, les bactéries et la levure. Le sang total est également relativement facile à utiliser, parce que les hématies peuvent être retirées par lysis et les types de globule blanc peuvent alors être recensés.

Des cellules doivent être produites à partir des tissus solides pour la cytométrie de flux. Ceci est fait en désagrégeant le tissu. La désagrégation mécanique fonctionne bien pour les tissus qui sont desserré liés, comme les cellules adhérentes de la culture de tissu, moelle osseuse, et le tissu lymphoïde.

Dans la désagrégation mécanique, le tissu haché dans une suspension est déménagé par un pointeau fin-mesuré à plusieurs reprises. Ceci peut être suivi du meulage, s'il y a lieu.

Le tissu peut également être désagrégé par des enzymes. Dans la désagrégation enzymatique, les enzymes touchent à des interactions entre les protéines et la matrice extracellulaire qui retient les cellules ensemble. Des enzymes sont choisies ont basé sur des facteurs tels que le pH, la température, et d'autres cofacteurs, que toutes influencent l'action des enzymes.

Souillure d'immunofluorescence directe et indirecte

Il y a différents techniques de coloration pour la cytométrie de flux. Parmi ces derniers est l'immunofluorescence souillant, qui peut être directe ou indirecte. La souillure directe d'immunofluorescence concerne traiter des cellules avec de l'anticorps fluorescent marqué.

La souillure indirecte est parfois appelée la technique de sandwich, où le réactif primaire n'est pas marqué mais est au lieu trouvé par un réactif secondaire qui fluorochrome-est marqué. Ceux-ci peuvent être des anticorps, où l'anticorps secondaire a la spécificité pour la primaire.

De façon générale, la souillure d'immunofluorescence est facile, mais la spécificité et l'intensité obligatoires peuvent être influencées par plusieurs facteurs.

Souillure unicellulaire

La souillure unicellulaire est une technique utilisée pour le dépistage des antigènes de surface. Le tissu lymphoïde ou le sang périphérique sont des exemples à partir de quelles suspensions unicellulaires peut être effectué.

Dans cette méthode, des cellules sont incubées dans les tubes ou des plaques de microtitre (plaques plates avec beaucoup de puits qui peuvent être employés pour renfermer des solutions) avec des anticorps. Les anticorps peuvent être non étiquetés ou marqués avec la fluorescence. Les cellules sont alors lavées avec une solution tampon pour éliminer les anticorps qui n'ont pas grippé aux cellules.

La suspension unicellulaire peut également être employée pour le dépistage des antigènes intracellulaires. Ceci exige de la membrane de plasma de permettre des teintures ou des anticorps, par les suspensions unicellulaires fixes et permeabilized. Il peut exactement mesurer le teneur d'ADN cellulaire. De plus, la perte de cellules est inférieure, que des moyens il peuvent être exécuté sur juste quelques cellules.

Des protocoles pour préparer des cellules pour la cytométrie de flux unicellulaire de suspension peuvent être modifiés pour trouver les antigènes, qui diffèrent légèrement dans leur sensibilité à la dénaturation, ou dans la façon dont les séjours d'anticorps bondissent à l'antigène après le permeabilization de la cellule.

L'interne et les antigènes de surface d'une cellule peuvent être mesurés simultanément en souillant les deux la surface de cellules pour l'expression d'antigène, ainsi que l'intracellulaire pour l'expression d'antigène. Cependant, le type de marquage d'anticorps est important, comme une partie, telle que la fluorescence de protéine de chlorophylle de peridinin (PerCP), est détruite après permeabilization.

Souillure non viable de cellules

Les cellules non viables sont les cellules mortes, et ont pour cette raison détruit leur intégrité de membrane. Ceci signifie qu'elles ne peuvent pas être employées dans les préparations fixes ou permeabilized de cellules. 7 l'aminoactinomycin D, ou le 7-AAD, peut être employé ici. 7-AAD fluorescent peut gripper l'ADN, mais ceci peut être bloqué en comprenant des actinomycines D, ou l'AD, qui n'est pas fluorescente.

Cellules de culture de tissu

La préparation des cellules de la culture de tissu est généralement plus facile que les suspensions unicellulaires. Les cellules qui sont développées en suspension peuvent être graduellement plues à torrents dans un tube à centrifuger, être centrifugées, et resuspendues en cytométrie de flux souillant le tampon.

Les lignées cellulaires adhérentes doivent être d'abord isolées. Une fois que détachés, des blocs restants doivent être dissociés. Ils peuvent être centrifugés et resuspendus en cytométrie de flux souillant le tampon et puis être employés pour la cytométrie de flux.

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Last Updated: Oct 23, 2018

Sara Ryding

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Sara Ryding

Sara is a passionate life sciences writer who specializes in zoology and ornithology. She is currently completing a Ph.D. at Deakin University in Australia which focuses on how the beaks of birds change with global warming.

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